Исследование комплексов ДНК-золотые наночастицы методами спектроскопии поглощения и динамического рассеяния света

• Автор: Пылаев, Тимофей Евгеньевич
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 121 с. : ил.

Список сокращений ЗНЧ - золотые наночастицы КЗ - коллоидное золото ЗНС - золотые наностержни ДРС - динамическое рассеяние света ПЦР - полимеразная цепная реакция ДССР - дифференциальный спектр светорассеяния ТЭМ - трансмиссионная электронная микроскопия оцДНК - одноцепочечная ДНК дцДНК - двухцепочечная ДНК кДНК - комплементарная ДНК ЦТАБ - цетилтриметиламмоний бромид ПЭИ - полиэтиленимин
ПДДА - полидиаллилдиметиламмоний хлорид
ФМ - флуоресцентная метка
ЗХВК - золотохлористоводородная кислота
ВИЧ - вирус иммунодефицита человека
SBM - single-based mismatch
ТВМ - three-based mismatch
PBS - phosphate buffered saline
RB - Rhodamine В
SD - standard deviation
LTR - long terminal repeat

СОДЕРЖАНИЕ
Введение
Глава 1. Литературный обзор и задачи исследования
1.1. Плазмонно-резонансные частицы в анализе ДНК
1.2. Классификация методов генодиагностики с использованием ЗНЧ
1.3. Колориметрическое детектирование ДНК в растворе
1.3.1. Использование модифицированных ЗНЧ для ДНК-детекции
1.3.1.1. Колориметрическая детекция ДНК по типу перекрестных сшивок
1.3.1.2. Колориметрическая детекция ДНК по механизму солевой агрегации ЗНЧ
1.3.2. Функционализация золотых наночастиц олигонуклеотидами по механизму физической адсорбции
1.3.3. Использование флуоресцентно-меченных зондов и ЗНЧ для детектирования олигонуклеотидов
1.3.4. Использование ДРС для детектирования агрегации ЗНЧ, вызванной реакцией гибридизации ДНК-ДНК
1.3.5. Обнаружение биомолекул с использованием аптамеров и ЗНЧ
1.4. Постановка задач исследования
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Реактивы и материалы
2.2. Оборудование
2.3. Измерение спектров рассеяния ЗНЧ
2.4. Буферные растворы и олигонуклеотиды, использованные в
работе
2.5. Получение золотых наночастиц

2.5.1. Получение частиц КЗ
2.5.2. Получение золотых наностержней
2.6. Подготовка олигонуклеотидов к работе
2.7. Колориметрический тест с золотыми наностержнями и положительно заряженными частицами КЗ
Глава 3. Использование немодифицированных положительно заряженных частиц КЗ и наностержней в детектировании олигонуклеотидов: сравнительная оценка
3.1. Колориметрический тест с золотыми наностержнями
3.1.1. Синтез и характеристика золотых наностержней улучшенной сигарообразной формы
3.1.2. Оптимизация колориметрического теста с наностержнями
3.1.3. Результаты колориметрического теста с ЗНС
3.2. Колориметрический тест с положительно заряженными частицами КЗ
3.3. Чувствительность и специфичность колориметрического и ДРС тестов
Глава 4. Применение цитратных частиц КЗ для исследования корреляции «золотого числа» РНК из зрелого зерна злаковых и бобовых растений с морозостойкостью сорта и для детектирования олигонуклеотидов флуоресцентным методом
4.1. Исследование корреляции значения «золотого числа» долгоживущей РНК из зрелого зерна злаковых и бобовых растений с морозостойкостью сорта

флуорофор/тушитель, генерируют сигналы «включения/выключения» (Tyagi, Kramer, 1996), MB широко используются в флуорометрических методах детекции ДНК/РНК последовательностей. Использование MB является уникальным по чувствительности и селективности по сравнению с другими флуоресцентными методами, но имеет достаточно высокую цену.
1.3.4. Использование ДРС для детектирования агрегации ЗНЧ, вызванной реакцией гибридизации ДНК-ДНК
Динамическое рассеяние света (ДРС), также известное как спектроскопия корреляции фотонов или квазиупругое рассеяние света, является широко используемым методом для изучения размера частиц и распределения по размерам. ДРС основано на регистрации броуновского движения частиц, которое вызывает Доплеровский сдвиг падающего света лазера. Измеряется диффузия частиц, и размер частиц рассчитывается в соответствии с формулой Стокса-Эйнштейна (Berne, Ресога, 1976). ДРС обычно используется для анализа размеров и распределения по размерам полимеров, белков, коллоидов и наночастиц. Ввиду сильного рассеяния света золотыми частицами, ДРС является очень чувствительным методом для количественного детектирования и анализа конъюгатов при низких концентрациях (Xie et al., 2007). В работе (Dai et al., 2008) метод ДРС был применен для детектирования ДНК-мишеней по схеме агрегации конъюгатов ЗНЧ на основе перекрестных сшивок. Совсем недавно группа Хана (Нап) разработала новый подход для детектирования ДНК с использованием немодифицированных цитрат-стабилизированных частиц КЗ и метода ДРС (Gao et al., 2011). Основа метода состоит в различном сродстве оцДНК и дцДНК к частицам КЗ, как показано в работе (Li, Rothberg, 2004b). Используя это различие в сродстве, авторы (Gao et al., 2011) описывают детектирование специфической последовательности гена нопалин-синтазы трансгенных