Получение и характеристика клонотеки к ДНК хрусталика глаза лягушки и идентификация клонов, кодирующих полипептиды бета-кристаллинов

• Автор: Козлов, Константин Андреевич
• Шифр специальности: 03.00.30
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 179 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
УСЛОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава I. Структура и макромолвкулярный состав линзы
глаза позвоночных
1.1. Клеточное строение хрусталика и общая характеристика его белков
1.1.Х. Структурные белки хрусталика
1.2. Тканеспецифичные белки хрусталика и кодирующие
их полинуклеотидные последовательности
1.2Л. Альфа-кристаллины
1.2.2. Структура альфа-кристаллиновых мРНК
1.2.3. Клонирование кодирующих последовательностей альфа-кристаллинов
1.2.4. Гамма-кристаллины
1.2.5. Структура гамма-кристаллиновых мРНК
и их клонирование
1.2.6. Дельта-кристаллины
1.2.7. Динамика синтеза мРНК дельта-кристаллинов
в ходе дифференцировки хрусталика
1.2.8. Клонирование дельта-кристаллиновых мРНК .
1.2.9. Другие таксон-специфичные кристаллины
Глава II. Еета-кристаллины: белки, мРНК, гены.
Молекулярное клонирование комплементарной ДНК

11.1. Физико-химические свойства нативных бета-кристаллинов
11.2. Свойства и структура бета-кристаллиновых субъединиц
11.3. Клонирование и анализ кодирующих последовательностей бета-кристаллинов
11.3.1. Основные характеристики бета-кристаллиновых мРНК
11.3.2. Клонирование и анализ бета-кристаллиновых последовательностей
11.4. Молекулярное клонирование комплементарной ДНК
11.4.1. Векторы клонирования
11.4.2. Стратегии клонирования кДНК
11.4.3. Методы клонирования кДНК
11.5. Заключение
МАТЕРИАЛЫ М МЕТОДЫ
I. Материалы
II. Методы
11.1. Получение хрусталиков лягушки
11.2. Выделение суммарной РНК из хрусталиков лягушки
11.3. Выделение поли(А)РНК хроматографией
на олиго(дТ)-целлюлозе
11.4. Синтез комплементарной цепи ДНК
11.5. Синтез второй цепи кДНК
11.6. Обработка двуспиральной кДНК нуклеазой В1
11.7. Синтез дГ- и дЦ-коннекторов
11.8. Отжиг дскДНК и вектора pBR

Трансформация бактериальных клеток
Лизис бактериальных колоний
на нитроцеллюлозных фильтрах
Гибридизация колоний
Радиоавтография фильтров
Выделение плазмидной ДНК с помощью ДСН-лизиса Выделение плазмидной ДНК быстрым фенольным
методом
Выделение плазмидной ДНК щелочным методом . . Препаративное выделение плазмидной ДНК
неионно-детергентным лизисом
Центрифугирование плазмидной ДНК в равновесном градиенте хлористого цезия с бромистым этидием
Рестрикционный анализ плазмидной ДНК
Электрофоретический анализ ДНК в агарозных
гелях и радиоавтография
Электрофоретический анализ рестрицированной
ДНК в полиакриламидных гелях
Электрофоретический анализ одноцепочечной кДНК в денатурирующем полиакриламидном геле .... Иммобилизация плазмидной ДНК
на нитроцеллюлозных мембранах
Гибридизация поли(А)РНК с иммобилизованной
плазмидной ДНК
Трансляция элюированной поли(А)РНК в бесклеточной системе ретикулоцитов кролика .

особый класс и вследствие их появления первыми при дифференциро-вке линзы птиц назвал FISC (first important soluble crystallin). Общепринятое сейчас наименование "делъта-кристаллин" было предложено Звааном и Икедой (Zwaan, Ikeda, 1965).
Сравнительный анализ 5-кристаллинов птиц и рептилий продемонстрировал их наличие у всех изученных видов, за исключением ехидны (Williams, PlatIgorsky, 1979a; de Jong et al., 1981). Нативные 5-кристаллины рептилий и птиц являются тетрамерными белкам массой около 200000 (Maisel, Langman, 1961; Williams, Piatigorsky, 1979a, б) и диссоциируют на субъединицы лишь в весьма жестких условиях (Piatigorsky, Zelenka, 1974).
Молекулярная масса 5-кристаллиновых субъединиц исследованных видов составляет около 50 кД, причем, по данным иммунохими-ческого анализа, 50 кД-фракция у всех видов имеет общие антигенные детерминанты (Williams, Piatigorsky, 1979а). При отсутствии какой-либо гомологии с другими классами кристаллитов, 5-кристал-лины имеют общие антигенные детерминанты с кератином (Kodama, Eguchi, 1983). Изоэлектрические точки 6-кристаллинов рептилий и птиц находятся в пределах pH 5-7, хотя рептилиям свойственны более щелочные изоточки этого диапазона (de Jong et al., 1981).
Наиболее хорошо изучены 6- кристаллины кур, молекула которых состоит из 4 субъединиц двух видов массой 48 и 50 кД при соотношении в нативном агрегате соответственно 3:1 (Reszelbaeh et al., 1977). Изменение концентрации Nat К+, 01“ и ацетата при трансляции 5-кристаллиновой мР'НК в бесклеточной системе может изменять соотношение субъединиц вплоть до обратного (Shinoliara, Р iatIgorsky, 1980).
Полипептид массой 48 кД образуется из 50 кД- субъединицы в