Взаимодействие протеасом и альфа-РНП частиц с фибрилярным актином

• Автор: Галкин, Витольд Эдуардович
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 119 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Строение и свойства малых рибонуклеопротеиновых омплексов
2.1Л. Протеасомы
2.1.1.1. Структура и свойства протеасом
2.1.1.2. Регуляция биологической активности протеасом
2.1.1.3. Участие протеасом в процессах клеточной регуляции
2.1.1.4. Взаимодействие протеасом с элементами цитоскелета в клетках
млекопитающих
2.1.2. а-Рибонуклеопротеиновый комплекс (а-РНП)
2.1.2.1. Структура и свойства а-РНП
2.1.2.2. Участие а-РНП в процессах контроля экспресси генов
2.2. Актин и актин связывающие белки
2.2.1. Структура и свойства молекулы актина
2.2.2. Структура и свойства фибриллярного актина
2.2.3. Структура и свойства актинсвязывающих белков
2.2.3.1. Белки взаимодействующие с О-актином
2.2.3.2. Копирующие белки
2.2.3.3. Белки связывающиеся вдоль нитей актина
2.2.4. Регуляция взаимодействия актина и актинсвязывающих белков
2.2.5. Участие актинового цитоскелета в регуляции экспрессии генов
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Культивирование клеток эпидермоидной карциномы человека А431 и эмбриональных фибробластов человека
3.2. Антитела используемые в работе
3.3. Иммунофлюоресцентная микроскопия
3.4. Приготовление цитозоля клеток линии А431
3.5. Получение цитозоля клеток печени крыс
3.6. Выделение 268 комплекса
3.7. Выделение 208-протеасом
3.8. Выделение а-РНП-частиц из гепатоцитов крысы
3.9. Аффинная хроматография на колонках с иммобилизованным Р-актином
3.10. Взаимодействие 268-комплекса с Р-актином
3.11. Взаимодействия 208-протеасом с Р-актином
3.12. Взаимодействие а-РРГП-частиц с Р-актином
3.13. Электрофорез и идентификация белков протеасом и а-РНП-частиц
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Изучение взаимодействия протеасом с Р-актином
4.1.1. Распределение протеасом и актиновых структур в нормальных эмбриональных фибробластах человека
4.1.2. Выявление взаимодействия протеасом гепатоцитов крысы и клеток эпидермоидной карциномы человека А431 с Р-актином методом аффинной хроматографии
4.1.3. 268-комплекс непосредственно взаимодействует с Р-актином
4.1.4. Исследование непосредственного взаимодействия 208-протеасом с Р-актином
4.1.5. Исследование влияния эпидермального фактора роста (ЭФР) на способность протеасом клеток линии А431 взаимодействовать с Р-актином
4.2. Взаимодействие а-РНП-частиц с Р-актином
4.2.1. Распределение а-РНП-частиц и актиновых структур в нормальных эмбриональных фибробластах человека
4.2.2. Сравнительный анализ белкового состава а-РНП-частицы и 268-протеасомы, выделенных из гепатоцитов крысы
4.2.3. Непосредственное взаимодействие а-РНП-частиц с Р-актином
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
6. ВЫВОДЫ
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.ВВЕДЕНИЕ.
Одной из важных и активно развивающихся областей клеточной биологии является изучение молекулярных механизмов функционирования цитоскелета и его участие в регуляторных процессах. Цитоскелет играет важную роль в поддержании формы клетки и в осуществлении многих её двигательных реакций, обеспечивающих такие важные клеточные функции, как деление, эндо- и экзоцитоз, перемещение клеток в пространстве, контакт их с субстратом и с другими клетками (Bershadsky, Vasiliev, 1988). В последнее время появилось много работ свидетельствующих об участии цитоскелета в регуляции экспрессии генов и проведении сигнала с поверхности клетки на ядро (Bissel, Barcellos-Hoff, 1987). Было показано, что механические усилия, вызываемые взаимодействием лиганда с рецептором вызывают локальное перераспределение связанных с актиновыми филаментами рибосом м-РНК и изменение уровня трансляции, что вероятно необходимо для быстрой регуляции синтеза белка (Chicurel et al., 1998). Более того, предполагается, что взаимодействие м-РНК с актиновыми филаментами необходимо для стабилизации м-РНК и осуществления трансляции (Bassell, Singel, 1997). Малые ГТФ-азы активируемые при взаимодействии лиганда с рецептором могут изменять пространственную организацию актинового цитоскелета (Ridley et al., 1992; Chardin et al., 1989; Paterson et al., 1990) через актинсвязывающие белки (Lassing, Linberg, 1985; Yin, 1987), что может являться способом передачи сигнала в ядро, так как способность цитоскелета принимать различные формы пространственной организации может обеспечивать специфичность передаваемой информации (Puck et al., 1990). В некоторых клетках актиновый цитоскелет также принимает участие в транспорте определённых м-РНК из ядра в необходимые компартменты клетки (Sundell, Singer, 1991) и участвует в распределении м-РНК в кортикальной области цитоплазмы (Bassell, Singel, 1997).
В последнее время в многочисленных работах было показано, что, наряду с белок синтезирующей системой, в клетке функционирует система деградации белка в основе которой лежит убиквитин-зависимый протеолиз белков протеасомами (Ciechanover, 1994). Эта система, вероятно, необходима для

Наблюдение и фотографирование клеток проводили с помощью микроскопов Opton и Zeis, снабженных соответствующими фильтрами.
3.4. Приготовление цитозоля клеток линии А431.
Клетки тщательно промывали тёплым PBS-буфером (137 мМ NaCl, 7 мМ Na2HP04 pH 7.4, 1.5 мМ КН2Р04, 2.7 мМ КС1) и снимали с подложки скребком в визирующем Е-буфере (5 мМ HEPES-KOH pH 7.5, 0.05% Nonidet-P40, 0.5 мМ EDTA, 0.5 мМ EGTA, 1 мМ DTT, 1мМ PMSF) при 4°С. Суспензию лизированных клеток гомогенизировали в ручном гомогенизаторе 10 мин на льду и центрифугировали при 12000 об/мин (11000 g, центрифуга К-24) при 4°С для удаления ядер и осколков мембран. Супернатант фильтровали, используя фильтр с диаметром пор 0.22 мкм (Millipore). Полученный цитозоль использовали сразу для хроматографии.
3.5. Получение цитозоля клеток печени крыс.
Использовали крыс-самцов весом до 150 г. Печень вырезали, отделяли от соединительной ткани, промывали 0.14 М раствором NaCl, измельчали и гомогенизировали 2 мин в 2.2 М растворе сахарозы с 0.5% глицерофосфата, 1 мМ MgCl2 и 5мМ PMSF. Гомогенат фильтровали через три слоя марли и наслаивали на 2.2 М сахарозу в центрифужных пробирках. Ядра отделяли центрифугированием в течение 90 мин при 35000 об/мин (150000 g, центрифуга Ж-62, ротор РУ-45) при 4 °С. Флотирующий слой липидов удаляли декантацией, а не содержащий ядра и липиды супернатант разбавляли А-буфером (50 мМ F1EPES-KOH pH 7.5, 0.05% Nonidet-P40,
0.5 мМ EDTA, 0.5 мМ EGTA, 1 мМ DTT, 1мМ PMSF) до концентрации сахарозы 0.25 М. Раствор осветляли центрифугированием 1 ч при 12000 об/мин (11000 g, центрифуга К-24) при 4 °С (и фильтровали, используя фильтр с диаметром пор 0.22 мкм (Millipore). Полученный цитозоль использовали сразу для хроматографии.
3.6. Выделение 26S комплекса.
Не содержащий ядра и липиды супернатант, полученный как в пункте 3.5., разбавляли буфером содержащим 10 мМ Трис-НС1 pH 8.0, 0.25 М КС1, 1 мМ EDTA, 10 мМ MgCl2 и 1 мМ АТФ, до концентрации сахарозы 0.25 М, инкубировали 15 мин