Защита эндотелиальных клеток сосудов человека от повреждения при ишемии in vitro : Роль белка теплового шока HSP27

• Автор: Локтионова, Светлана Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 131 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ВСТРЕЧАЮЩИХСЯ В ТЕКСТЕ
ДИССЕРТАЦИИ
I.ВВЕДЕНИ Е
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: Белки теплового шока, истощение АТФ и
толерантность к ишемии
1. Белки теплового шока: свойства, функции, регуляция экспрессии.
1.1. Общая характеристика белков теплового шока
1.2. Класс НБРЮО
1.3. Класс НБРЭО
1.4. Класс НБР70
1.4.1. Краткая характеристика класса Н6Р70
1.4.2. Функции НБР70
1.5. Класс НЭРбО
1.6. Семейство малых НЭРэ (НЭР27 и альфа-
кристаллины)
1.6.1. Краткая характеристика семейства малых
НЭРв
1.6.2. Фосфорилирование малых НЭРэ
1.6.3. Функции малых НБРэ
1.7. Убиквитин
1.8. Другие представители стресс-белков и шаперонов
1.9. Индукция НБРб
2. Истощение АТФ как "протеотоксический" стресс
2.1. Энергетический баланс клетки
2.2. Падение уровня клеточного АТФ как причина ионного дисбаланса при
ишемии
2.3. Агрегация и инактивация ферментов
2.4. Дефосфорилирование белков
2.5. Разрушение и реорганизация цитоскелета
2.5.1. Разрушение акгиновых микрофиламентов при падении уровня клеточного АТФ
2.5.2. Влияние истощения АТФ на организацию микротрубочек
2.5.3. Влияние истощения АТФ на промежуточные филаменты
2.6. Увеличение коньюгации внутриклеточных белков с убиквитином
2.7. Истощение клеточного АТФ вызывает активацию генов теплового шока
3. Участие НБРэ в защите клеток от ишемического повреждения
3.1. Участие НЭР70 в защите клеток от ишемического стресса
3.2. Участие малых НЭРэ в защите клеток от ишемического стресса
Заключение
III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Выделение, культивирование и идентификация в культуре эндотелиальных клеток сосудов человека
1.2. Выделение эндотелиальных клеток
1.3. Культивирование эндотелиальных клеток
1.4. Идентификация эндотелиальных клеток в культуре
2. Имитирующий ишемию метаболический стресс
3. Предобработка клеток
4. Измерение уровня АТФ в клетках
5. Измерение внутриклеточного Са2+
6. Флуоресцентная микроскопия
/.Определение концентрации F-актина в ЭК на
спектрофлуориметре
8. Клеточное фракционирование неионным детергентом Тритоном X
9. Электрофорез и иммуноблоттинг
10. Анализ изоформного спектра HSP27
11. Статистическая обработка результатов

2.5.3. Влияние истощения АТФ на промежуточные филаменты.
Для своей сборки или разборки промежуточные филаменты не нуждаются в присутствии АТФ. Тем не менее, они очень чувствительны к энергетическому истощению. Было показано разрушение этих цитоскелетных структур и скопление агрегировавшего виментина вокруг ядер в клетках HeLa при разобщении окислительного фосфорилирования [Maro et al., 1982]. Агрегацию промежуточных филаментов наблюдали в опухолевых клетках мыши при ингибировании дыхания ротеноном [Kabakov and Gabai, 1993]. Также, как и в случае актинового цитоскелета ’’энергетическое голодание” вызывает отделение промежуточных филаментов от клеточной мембраны. Потеря связи десминовых филаментов с сарколеммой и ядерной мембраной была показана в подвергшихся аноксии кардиомиоцитах, при этом также разрушалась связь промежуточных филаментов с мембраной митохондрий [Ganote et al., 1987]. Разрушение связи десминовых филаментов с сарколеммой трактуется рядом исследователей как основное событие в механизме ишемического повреждения миоцитов [Ganote and Armstrong, 1993]. Причины разрушения и отсоединения от мембран промежуточных филаментов при истощении АТФ пока не ясны. Вероятно здесь участвуют стресс-акгивируемые или Са2+-активируемые протеазы, подобные кальпаину. Возможно, что неспирализованные области промежуточных филаментов очень чувствительны к протеолизу, протеолиз же этих областей ведет к разборке филаментных структур.
2.6. Увеличение коньюгации внутриклеточных белков с убиквитином.
Так как in vivo Ub связывается со ’’старыми” и дефектными белковыми молекулами, предназначенными для АТФ-зависимой деградации в протеосомах, то увеличение Ub-белковых коньюгатов в постишемических клетках должно отражать протеотоксичность ишемического стресса. Сообщалось, что в начальный период реперфузии после короткой ишемии мозга происходило полутора кратное увеличение содержания Тритон X-100-нерастворимых коньюгатов Ub и высокомолекулярных белков