Топологическое состояние ДНК в интерфазных ядрах и метафазных хромосомах

• Автор: Кузин, Федор Эдмундович
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 131 с.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
§ 1.1, Топология ДНК
1.1.1. Топологически замкнутая ДНК может быть сверхспирализована и торсионно напряжена
1.1.2. ДНК в ядре топологически замкнута
1.1.3. Влияние сверхспирализации на ДНК-зависимые процессы
§.1.2. Механизмы изменения топологического статуса ДНК
1.2.1. Способы устранения торсионных напряжений в ядерной ДНК
1.2.2. Механизмы создания торсионных напряжений в ДНК
§ 1.3. Методы регистрации торсионных напряжений
1.3.1. Топология ДНК минихромосом
1.3.2. Топология ДНК интерфазного хроматина
1.3.3. Изучение вторичной структуры ДНК метафазных хромосом
§ 1.4. Итоги обзора литературы
1.4.1. Постановка задачи исследования
1.4.2. Способы реализации поставленной задачи
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ
§ 2.1. Подготовка исследуемого материала
§ 2.2. Процедура определения топологического состояния ДНК
§ 2.3. Анализ сайтов расщепления ДНК топоизоиеразой
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ПРОВЕДЁННОЙ РАБОТЫ

§ 3.1. Торсионные напряжения в ДНК политенных хромосом

3.1.1. Часть ДНК политенных хромосом торсионно напряжена
3.1.2. Торсионно напряжена транскрибируемая ДНК

политенных хромосом
3.1.3. Результаты, получаемые in situ, отражают топологическое

состояние ДНК в живои клетке
3.1.4. Существует механизм поддержания стабильного торсионного напряжения в ДНК

3.1.5. Топологический механизм регуляции активности топоизомеразы
3.1.6. Величина торсионного напряжения не зависит от
интенсивности транскрипции
§ 3.2. Торсионные напряжения в ДНК метафазных хромосом
и интерфазных ядер
3.2.1. Большая часть ДНК метафазных хромосом
торсионно напряжена
3.2.2. Напряжения в ДНК интерфазного хроматина
3.2.3. Торсионные напряжения в ДНК интерфазного ядра
существуют до активации генов
§ 3.3. Влияние бромистого этидия на структуру хроматина
3.3.1. Большие концентрации красителя изменяют
структуру хроматина
3.3.2. Изменениям подвергается транскрипционно неактивный
эухроматин, содержащий торсионно не напряжённую ДНК
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ
§4.1. Оценка точности полученных результатов
§ 4.2. Торсионные напряжения в ДНК интерфазного ядра
4.2.1. Регуляция ДНК-релаксирующей функции топоизомеразы 1
4.2.2. О причинах торсионно напряжённого состояния ДНК
интерфазного хроматина
§ 4.3. Торсионные напряжения в ДНК метафазных хромосом
4.3.1. Механизм возникновения напряжений
4.3.2. Значение напряжений в ДНК метафазных хромосом

§ 4.4. Топология ДНК и состояние хроматина
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Список принятых сокращений
Z-ДНК - Left-handed DNA structures
н-днк - Triplex-DNA structures
MARs/SARs - Matrix attachment region/Scaffold attachment region
HMG - High-mobility group
SMC - Structural maintenance of chromosomes
SDS - Sodium dodecyl sulfate
PIPES - 1,4-Piperazine-diethanesulfonic acjd
PMSF - Phenyimethanesulfonyl fluoride
ЭДТА - Ethylenediaminetetraacetic acid
DTT - dl-Dithiothreitol
Трис - 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol
XCAP - Xenopus chromosome-associated polypeptides
АТФ - Аденозин 5’-трифосфат
OPC - Относительная разность скручивания
БЭ - Бромистый этидий
НТФ - Нуклеотидтрифосфат
no. - Пары оснований
Lk - Топологическое число зацеплений молекулы ДНК
Tw - (скручивание) - число спиральных витков в ДНК
ALk - Число сверхвитков молекулы ДНК
Wr - Число третичных витков в молекуле ДНК
et а!., 1999), выявило такую ситуацию только в одном случае (Ljungman and Hanawalt, 1992).
В свою очередь, ряд фактов, свидетельствующих о корреляции транскрипции с торсионными напряжениями в ДНК, можно объяснить тем, что само взаимодействие транскрипционных факторов с ДНК, или сборка транскрипционного комплекса, приводит к возникновению напряжений. Об этом свидетельствует изучение структуры последовательностей способных принимать крестообразную геометрию в условиях отрицательных торсионных напряжений спирали ДНК. Для исследования конформации таких последовательностей, расположенных перед 5' концом гена бета-глобина ксенопуса, ДНК которого собиралась в хроматин при инъекции в ооциты лягушки, использовали нуклеазу Р1, специфичную для неспаренных цепей (Leonard and Patient, 1991). Картина расщепления этой нуклеазой говорила о напряжённом состоянии ДНК многих матриц в собранном хроматине. Более того, количество торсионно напряжённых матриц резко увеличивалось при активации транскрипции на этом хроматине. Однако не было замечено изменений ни в величине торсионных напряжений, ни в количестве напряжённой ДНК матриц, если элонгация РНК полимераз была блокирована альфа-аманитином. В другом эксперименте измеряли торсионное напряжение ДНК гена дигидрофолатредуктазы в клетках хомячка, стимулированных и не стимулированных к транскрипции. Напряжение присутствовало только на ДНК стимулированных клеток, даже если не было элонгации транскрипции. Интересно, что несмотря на большой размер петлевого домена (50 т.п.о), содержащего исследуемый ген, в опыте было зарегистрировано напряжённое состояние только для ДНК содержащей промоторную область, 1,3 т.п. о. (Ljungman and Hanawalt, 1995).
Таким образом, ряд фактов свидетельствует о том, что торсионное напряжение ДНК может коррелировать с активацией транскрипции, но не быть связано с её элонгацией.
ДНК-свеохспирализующая активность геликаз. Модель "двойного домена" реализуется и при работе ДНК-геликаз (Droge, 1994). Эти ферменты раскручивают дуплекс ДНК и передвигаются вдоль него в реакции, связанной с гидролизом 5'-нукпеозидтрифосфатов. Например, инкубация топологически замкнутой и релак-сированной плазмидной ДНК с SV40 Т антигеном, АТФ и прокариотической то-поизомеразой I приводила, как и следовало ожидать из рассматриваемой моде-