Разработка комплексной технологии получения высокоочищенного препарата эпидермального фактора роста на основе рекомбинантных штаммов Saccharomyces cerevisiae

• Автор: Вещикова, Елена Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 136 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1. Пептидные ростовые факторы
1.1. Основные свойства ростовых факторов
1.1.1. Бифункциональность
1.1.2. Индукция синтеза других ростовых факторов
1.1.3. Несколько мест синтеза ростовых факторов
1.1.4. Связь с протоонкогенами
1.1.5. Физиологическая роль в организме
1.2. Механизм действия
2. Эпидермальный фактор роста
2.1. Физиологическая роль в организме в норме
2.2. Физиолоогическая роль ЭФР при патологии
3. Методы получения высокоочищенного препарата
3.1. Структура ЭФР
3.2. Биотехнологические методы синтеза ЭФР
3.3. Основные способы выделения ЭФР
3.4. Использование аффинной хроматографии для получения и очистки ЭФР
4.Увеличение продуктивности рекомбинантных штаммов 5.сегеу/з/ае
4.1. Технология получения гетерологических протеинов в & сеж/мае
4.2. Питание и рост 5. сегеу/а/ае
4.3 Повышение стабильности плазмид
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Получение ЭФР-обогащенной фракции из подчелюстных желез мышей-самцов
2. Очистка ЭФР хроматографией на биогеле и ИОХ
3. Хроматографические методы очистки ЭФР-обогащенной фракции
4. Культивирование рекомбинантных штаммов S. cerevisiae
5. Получение ЭФР-обогащенной фракции из культуральной
жидкости S. cerevisiae
6. Иммунизация животных
7. Определение титра антител против ЭФР в иммунной сыворотке
8. Выделение иммуноглобулинов из сыворотки иммунизированных
животных
9. Получение иммуносорбентов
10. Выделение ЭФР из культуральной жидкости S. cerevisiae методами иммуносорбции
11. Хранение рекомбинантных штаммов S. cerevisiae
12. Обработка дрожжевых клеток ультразвуком
13. Получение гидролизата казеина - компонента питательной среды
14. Получение суспензий клеток различных слоев эпидермиса
15. Гель-фильтрация
16. Диск-электрофорез
16.1. Дисковый электрофорез по методу R.T.Swank
16.2. Дисковый электрофорез по Шелудько Н.С
17. ВЭЖХ (аналитический вариант)
18. Аминокислотный анализ
19. Определение биологической активности ЭФР
19.1. in vivo
19.2. in vitro
20. Определение включения меченных предшественников в клетках различных слоев эпидермиса
21. Определение влияния ЭФР на репликативную активность клеток различных слоев эпидермиса
22. Определение радиоактивности клеток
23. Определение белка, ДНК, РНК, триптофана, свободных аминогрупп, статистическая обработка результатов
23.1. Определение белка
23.2. Определение ДНК
23.3. Определение РНК
23.4. Определение триптофана
23.5. Определение свободных аминогрупп
23.6. Статистическая обработка результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
1. Методы выделения и очистки ЭФР
1.1. Характеристика препарата ЭФР, полученного из слюнных
желез мышей-самцов
1.2. Характеристика препарата ЭФР, полученного из культуральной жидкости рекомбинантных штаммов S.cerevisiae с помощью хроматографической очистки
1.3. Характеристика препарата ЭФР, полученного с помощью аффинной хроматографии из культуральной жидкости рекомбинантных штаммов S.cerevisiae
1.4. Сравнение препаратов ЭФР, получаемых различными
методами
2. Влияние ЭФР на пролиферативную активность клеток
различных слоев эпидермиса
3. Особенности культивирования рекомбинантных штаммов
S.cerevisiae
3.1. Культивирование рекомбинантных штаммов на среде Yeast Nitrogen Base (YNB) с Casein hydrolisate acids "Difco"
3.2. Влияние замены YNB на искусственно-композиционную среду
3.3. Замена Casein hydrolisate acids "Difco"Ha гидролизат казеина
3.4. Сравнение способов культивирования между собой

тичной структур молекулы для сохранения способности связывания с рецепторами и для биологической активности ЭФР.
На основании прямых и косвенных данных исследования молекулы ростового фактора и различных ее модификаций сделан вывод, что связывающий участок молекулы ЭФР находится в районе 20-31-го аминокислотных остатков, а 1ЧН2- и СООН-концевые домены молекулы важны для
поддержания необходимой стабильной конформации рецепторсвязываю-щего участка. Кроме того, карбоксильный концевой район молекулы участвует в образовании комплекса ЭФР со связывающим белком.
Радиоиммунологическими методами ЭФР-подобные белки обнаружены у представителей следующих отрядов класса млекопитающих: приматов, хищных, грызунов, зайцеобразных, насекомоядных, парнокопытных, а также у отдельных птиц и амфибий. Подобная распространенность ЭФР-подобных факторов говорит об их жизненноважном значении для существования животных и позволяет изучать видоспецифические отличия ЭФР. ЭФР-подобные полипептиды выделены в чистом виде из мыши, крысы, морской свинки, человека и собаки [47, 103]. Для многих из них установлена последовательность аминокислот (рис.2).
ИЗИТв С РРБУЛСУ С в V с МУУЕЗУЛЛУУ С1МСУЮУ1СЕЛС СЖИЛ I Л А
ИЗУРв С РЭБУЛвУ С ЬЫв GVC МЫЕБШЗУТ СГМСУУЭСЛЛС ОТЛЛ [_ ЛЛ/Л/Е1_Л Б СШАРв С РРЭНЛвУ С в V С МЖЕЭНМТУА С1МСУ1СУУСЕЛС ЕНОЛ 1_ 01-МЕ В ИЭЛЭЕ С Р1_ЗН ЛйУ С НМЛ в V С МУ1ЕАШКУА СЫСУУСУЮЕЛС ОУЛЛ I КМЛ/Е1.Л Г
Рис.2. Аминокислотная последовательность ЭФР, выделенного из разных источников: А - слюнных желез крысы; Б - слюнных желез мыши; В -слюнных желез морской свинки; Г - мочи человека. Для обозначения использованы однобуквенные символы согласно правилам, принятым 1ЫРАС - 1ЫВ. N - асн Э - сер Т - тре Э - гли С - цис Р - про У - тир й -асп I - лей V - вал М - мет Е - глу И - арг I - иле <3 - глн Н - гис Л/ - три А - ала К - лиз [15].