Метаболические аспекты биосинтеза полигидроксибутирата/валерата аэробными метилобактериями

• Автор: Короткова, Наталья Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 114 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АПБ - ацилпереносящий белок
БСА - бычий сывороточный альбумин
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
ГХ - газовая хроматография
ДЦТ - 1,4-дитиотреитол
ДТНБ - 5,5-дитио-бис-2-нитробензойная кислота
ДХФИФ - 2,4-дихлорфенол и ндофенол
ицл' - отсутствует изоцитратлиаза
МФ - метанофуран
ОП - оптическая плотность
ПААГ - полиакриламидный гель
ГТГА - поли-3-гидроксиалканоаты
ПГБ - поли-3-гидроксибутират
ПГВ - поли-3-гидроксивалерат
ПГБВ - сополимер З-гидроксибутирата/З-гидроксивалерата
ТГМТТ - тетрагидрометаноптерин
ТГФ - тетрагидрофолат
Трис - трис(гидроксиметил)аминометан
ФЕП - фосфоенолпируват
ФМС - феназинметосульфат
ЦТК - цикл трикарбоновых кислот
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
3ГБ - 3-гидроксибутират
ЗГВ - 3-гидроксиваперат

3.12. Методы количественного анализа ПГБ/В
3.13. Определение метаболитов в культуральной жидкости
3.14. Методы анализа физико-химических свойств ПГБ/В
3.15. Аналитические методы
РЕЗУЛЬТАТЫ
Глава 4. Новый метод анализа ПГБ/В с использованием ВЭЖХ
Глава 5. Биосинтез ПГБ/В метилобактериями
5.1 Отбор штаммов-продуцентов ПГБ
5.2. Влияние компонентов минеральной среды на синтез ПГБ у метилобактерий
5.3. Биосинтез ПГБВ M.extorquens, M.helvetica и Р.methylutens при культивировании
на различных соединениях
5.4. Подбор оптимальных концентраций пропанола и пентанола для биосинтеза ПГБВ
5.5. Свойства ПГБ/В: температура плавления и молекулярный вес
5.6. Ферменты биосинтеза и деградации ПГБ у M.extorquens и M.helvetica
5.7. Ферменты метаболизма пропанола и пентанола у M.extorquens, M.helvetica
Глава 6. Физиолого-биохимические особенности биосинтеза ПГБ/В у M.extorquens
6.1 Биосинтез ПГБ/В M.extorquens при периодическом культивировании в ферментере
6.2. Метаболические изменения при культивировании M.extorquens на метаноле и
на смеси метанола/пентанола
6.3 .Уровни внеклеточных метаболитов при культивировании M.extorquens на метаноле
Глава 7. Анализ углеродных потоков в СОг, ПГБ/В и биомассу при росте метилобактерий на различных субстратах
7‘1. Анализ углеродных потоков при росте на метаноле, ацетате и бутирате
7.2. Математическая модель метаболизма метанола и ацетата
7.3 Влияние ингибиторов на биосинтез ПГБ и внутриклеточное содержание НАД(Ф)Н 88
7.4. Включение 14С из пропанола, пентанола, пропионата и валерата в СОг, ПГБВ и биомассу
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ юо
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

4.14. Методы анализа физико-химичеких свойств ПГБ/В
ПГБ/В экстрагировали из лиофилизованной биомассы хлороформом и переосаждали десятью объемами метанола. Выпавший в осадок полимер отделяли от растворителей фильтрацией.
'Н-ЯМР-спектроскопию использовали для анализа ПГБ, выделенного из биомассы, выращенной на метаноле и на смеси метанола и 5 мМ фторацетата.
Молекулярный вес образцов ПГБ/В определяли гель-эксклюзивной хроматографией на колонке (4x200 мм), заполненной микросферическим сорбентом на основе силикагеля (эксклюсфер линейный) (Элсико, Россия), с использованием ВЭЖХ на жидкостном хроматографе высокого давления (LKB, Швеция), оборудованном рефрактометрическим детектором (RIDK 101, Чехословакия). Исследуемый образец ПГБ/В (1-10 мг) растворяли в хлороформе и анализировали на колонке со скоростью потока 0.2 мл/мин, подвижная фаза - хлороформ. Калибровочное уравнение определено при анализе полистиреновых стандартов (Aldrich, США) с известными молекулярными весами (Да): 850000, 641340, 401340,216000, 114200.
Температуру плавления ПГБ/В определяли при помощи блока Кофлера (Nagema, Г ермания).
4.15. Аналитические методы
Концентрацию ионов фосфора в среде определяли с малахитовым зеленым по методу (Быстрых и Троценко, 1983). Концентрацию ионов аммония в среде культивирования определяли при помощи аммонийселективного электрода на анализаторе "Ion Analyzer ЕА - 940" (Orion Research Inc., США), калибруя прибор каждый раз перед началом измерений по стандартным растворам N11,(01.
Для определения общего содержания белка в биомассе, клетки гидролизовали 2 час 1 N КОН при 70° С. Гидролизат биомассы центрифугировали (30 мин, 5000 g), и в супернатанте определяли концентрацию белка по методу Лоури.
Для определения радиоактивности жидкие образцы помещали во флакон с 10 мл сцинтиляционного коктейля Unisolve 100, а сухие образцы - во флакон с 10 мл сцинтиляционной смеси, содержащей 4 г 2,5-дифенилоксазола (ППО) и 0.05 г 1,4-ди-2(5-