Клеточные механизмы мутагенеза и антимутагенеза : Исслед. на модел. микроорганизмах с помощью специф. мутагенов

• Автор: Павлов, Юрий Иванович
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 44 с.; 20х15 см

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы.
Нарушение механизма точного воспроизведения генетического материала увеличивает частоту мутаций, что у человека выражается в возрастании частоты наследственных болезней и рака. Мутации возникают преимущественно в определенных сайтах генома, предрасположенных к мутированию, которые называют «горячими точками» мутагенеза. В нашей работе мы исследовали многоступенчатые механизмы появления мутаций и природу сайтов с аномально высоким уровнем мутабильности.
Значительная часть спонтанных мутаций происходит при репликациии ДНК. Известно, что механизм обеспечения высокой точности репликации ДНК у Escherichia coli включает три последовательных этапа: выбор комплементарных матрице нуклеотидов ДНК-полимеразой III, коррекцию ошибок с помощью 3'->5' экзонуклеазной активности s-субъединицы ДНК-полимеразы III и пострепликативную репарацию неспаренных оснований. Механизмы контроля точности репликации ДНК эукариот изучены значительно меньше. В частности, неясно, какие ДНК-полимеразы участвуют в репликации основной части генома эукариот; какую роль играют 3'—>5' экзонуклеазы, ассоциированные с репликативными ДНК-полимеразами, в контроле точности репликации хромосом; как организована репликация лидирующей и отстающей нитей ДНК. В работе мы разработали оригинальный подход к анализу этих проблем, применяя аналоги оснований в качестве специфического инструмента для выявления ошибок репликации, происходящих при репликации разных нитей ДНК.
Индуцированные мутации происходят при ошибках репарации и репликации, вызываемых нарушениями структуры ДНК. Важной задачей в настоящее время является расшифровка механизмов действия химических мутагенов, которые, как выяснилось, являются постоянно действующим фактором окружающей среды. Мы исследовали механизмы, защищающие ДНК и клетку от химических мутагенов, начиная с поступления/транспорта мутагена в клетку, метаболизма, до реакции с ДНК и действия систем репарации и репликации поврежденной ДНК при становлении мутации. Для этого мы изучили у дрожжей и бактерий действие мутагенов разного типа, создавая и используя специальные системы для анализа генетического контроля и специфичности мутагенеза.
Дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются одним из наиболее удобных для генетических исследований эукариотическим объектом благодаря сравнительной простоте их организации и возможности комплексного использования в работе с ними генетических и молекулярно-биологических подходов. В то же время, сходство —типизации клеток .дрожжей и высших эукариот делает дрожжи уникальной моделью для -учения механизмов, действующих в клетках всех эукариотических организмов.Применение дрожжей позволило исследовать механизмы возникновения мутаций не только у гаплоидных, но и у диплоидных клеток. Теоретические исследования | механизмов мутагенеза в работе позволили создать и апробировать систему штаммов i дрожжей-индикаторов генетически опасных факторов.
Задачи исследования.
5 Создание систем для анализа механизмов возникновения мутаций у прокариоти-
пческих и эукариотических микроорганизмов. Изучение механизмов становления мутаций Длри ошибках репликации и репарации, клеточных систем защиты от мутагенов, особенностей мутагенеза в диплоидных эукариотических клетках. Создание штаммов дрожжей ,, для регистрации генетически опасных факторов окружающей среды.

Положения, выносимые на защиту.
Возникновение мутаций при действии химических мутагенов у эукариот -многоступенчатый процесс, включающий: поступление в организм, превращения мутагена неспецифической системой метаболизма чужеродных соединений, транспорт/проникновение в клетки-мишени, превращения мутагена специфическими для него системами активации/дезактивации, реакции с основаниями ДНК или включение в ДНК, репарацию модифицированной ДНК и репликацию ДНК, содержащей или бреши, или необычные основания. Вероятность появления новой последовательности ДНК (мутации) зависит не только от типа модификации ДНК, но и от локального контекста ДНК вблизи сайта мутации, типа реплицирующейся нити (лидирующей или отстающей) и от функционаьного состояния аппарата репликации.
Научная новизна.
В работе для анализа механизмов мутагенеза использованы микроорганизмы: прокариоты - бактерии E. coli и Salmonella typhimurium и эукариоты - дрожжи Saccharomyces cerevisiae и Pichia methanolica. Применены три основных подхода: а) исследование частоты индуцированных мутаций у мутантов по системам защиты от мутагенов или в системе микроорганизмы-индикаторы/клеточные экстракты печени животных и птиц; б) конструирование штаммов-детекторов мутаций, позволяющих определять тип и механизм возникновения мутаций, индуцированных мутагенами; в) использование специально подобранных мутагенов, различающихся по механизму действия (так, аналоги оснований вызывают мутации при ошибках репликации, УФ-свет -при ошибках репарации, пропиолактон - при ошибках и репарации, и репликации).
В результате впервые:
♦ исследована метаболическая активация 2-аминофлуорена (2-АФ) и инактивация N-метил-У’-нитро-У-нитрозогуанидина в тесте дрожжи/микросомы. Показано, что мутагенная активность 6-У-гидроксиламинопурика (ГАП) не модифицируется препаратами микросом; микросомы печени курицы обладают более высокой активностью по превращению 2-АФ в мутаген, по сравнению с препаратами печени мышей
♦ установлено, что система эксцизионной репарации дрожжей предотвращает возникновение мутаций при действии метаболитов 2-АФ и 2-ацетил-АФ
♦ получены мутанты haml у дрожжей, сверхчувствительные к мутагенному действию аналога оснований Г АП; показано, что ген НАМ1 консервирован в эволюции - имеет гомологи у широкого спектра организмов, от кишечной палочки до человека, следовательно, играет важную роль в жизнедеятельности клетки; установлена локализация новых генов, отличающихся от гомолога гена НАМ1, контролирующих мутагенное и летальное действие аналогов оснований у бактерий
♦ показано, что мутагенное действие ГАП у дрожжей модифицируется генетическими блоками путей биосинтеза и реутилизации пуринов (мутации adel, ade2, ade 12, aahl, aprtl). В результате получена возможность искусственно контролировать эффективность мутагенного действия Г АП на дрожжи
♦ установлено, что мутагенное действие аналога оснований Г АП у бактерий и дрожжей не зависит от общих систем репарации: эксцизионной, рекомбинационной, репарации неспаренных оснований; Г АП не является индуктором митотической рекомбинации у дрожжей
♦ показано, что и дТТФ, и дЦТФ включаются в ДНК напротив аналога оснований 6-N-гидроксиламинопурина (ГАП) in vitro Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы 3 при использовании олигонуклеотида-матрицы, содержащего данный аналог основания в определенном положении, причем дТТФ включался более эффективно, чем дЦТФ

произведению частот мутирования исходных гаплоидных штаммов и составит около 0,1 X 10'6, что более чем на два порядка меньше, чем частота, реально наблюдаемая в эксперименте. В чем разрешение этого очевидного парадокса? Мы предположили, что частота выявления ГАП-индуцированных мутантов у гаплоида не отражает истинную частоту их появления. Для того, чтобы оценить частоту индукции мутантов в одной копии гена L YS2 у диплоида, мы исследовали природу Lys- клонов, индуцированных ГАП у гетерозиготного по гену LYS2 диплоида D362. Оказалось, 85% из них гетероаллельны (проверено 196 клонов), то есть возникли не при митотической гомозиготизации рецессивной аллели, а при возникновении новой мутации. Следовательно, частота мутирования одной копии гена LYS2 у диплоидов - около 2 X НУ3. Расчетная частота одновременного мутирования обоих гомологов - в этом случае - 4 X I О-6, что ближе к экспериментальной частоте. Эти эксперименты подтвердили ранее сделанный вывод о том, что ГАП не индуцирует митотическую рекомбинацию у дрожжей (см. Глава 2), уже для случая межгенной рекомбинации. Для того, чтобы подтвердить необходимость диплодного состояния для высокой частоты возникновения мутантов при действии ГАП, мы сконструировали гаплоид с дупликацией гена LYS2 и показали, у него мутанты Lys' практически не возникают, тогда как у диплоида с тремя копиями LYS2 ГАП-мутабильность существенная, такая же, как и у триплоида.
Каковы же причины пониженной ГАП-мутабиьности гаплоидов? Мы предполагаем, что большую часть индуцированных у них мутантов мы не выявляем, так как ГАП индуцирует, помимо мутаций в гене LYS2, мутации в жизненноважных генах дрожжей. Это приводит к гибели мутантных гаплоидных клеток. У диплоидов данные дополнительные мутации находятся в гетерозиготном состоянии и не приводят к гибели клетки. Для проверки этого преположения мы провели тетрадный анализ обработанных ГАП клонов диплоидного штамма. Результаты экспериментов по оценке выживания