Изучение особенностей первичной структуры генома вакцинного штамма вируса табачной мозаики V-69

• Автор: Снегирева, Полина Борисовна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 134 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Организация генома ВТМ
2.1.1. Геном ВТМ содержит три открытые рамки считывания
2.1.2. Структура концевых некодирующих участков генома
2.1.3. Субгеномные мРНК
2.1.4. Сборка вирусных частиц
2.2. Репликация и синтез вирусных белков
2.3. Ближний транспорт ВТМ
2.3.1. Плазмодесмы в системе межклеточного транспорта растения
2.3.2. Вирусы растений кодируют специальные транспортные белки
2.3.3. Транспортный белок ВТМ
2.3.4. Механизм межклеточного транспорта ВТМ
2.4. Дальний транспорт ВТМ
2.5. Перекрестная защита растений
2.5.1. Феномен перекрестной защиты и успехи ее практического использования
2.5.2. Механизм перекрестной защиты
2.5.3. Молекулярные основы аттенуации вакцинных штаммов
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Материалы
3.1.1. Растительный материал
3.1.2. Бактериальные штаммы
3.1.3. Плазмидные векторы
3.1.4. Олигонуклеотидные праймеры
3.1.5. Ферментные препараты
3.1.6. Реактивы и расходные материалы
3.1.7. Среды
3.1.8. Фотоматериалы
3.2. Методы
3.2.1. Получение препарата РНК ВТМ У
3.2.1.1. Получение и осветление экстракта
3.2.1.2. Дробное высаливание вирусных частиц
3.2.1.3. Дальнейшая очистка препарата вирусных частиц
3.2.1.4. Выделение геномной РНК ВТМ У
3.2.2. Синтез кДНК генома ВТМ У
3.2.2.1. Получение набора случайных фрагментов кДНК генома ВТМ У
3.2.2.2. Направленный синтез перекрывающихся фрагментов кДНК
с пар специфических праймеров
3.2.3. Встраивание кДНК в вектор
3.2.4. Трансформация бактериальных клеток рекомбинантными плазмидами
3.2.5. Выделение плазмидной ДНК
3.2.6. Полимеразная цепная реакция (ПИР)
3.2.7. Реакции секвенирования
3.2.7.1. Секвенирование по Максаму и Гилберту
3.2.7.2. Секвенирование по Сэнгеру
3.2.8. Электрофоретическое разделение продуктов реакций секвенирования
в полиакриламидном геле (ПААТ)
3.2.8.1. Приготовление секвенирующего геля
3.2.8.2. Проведение электрофореза
3.2.8.3. Обработка геля после электрофореза
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Клонирование генома ВТМ У
4.1.1. Клонотека случайных фрагментов кДНК генома ВТМ У
4.1.2. Клонотека перекрывающихся фрагментов кДНК генома ВТМ У
4.2. Нуклеотидная последовательность геномной РНК вакцинного штамма У-69 вируса табачной мозаики
5. ОБСУЖДЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВТМ - вирус табачной мозаики ВОМ - вирус огуречной мозаики ДТ - десмотубула
ЗФБ - зеленый флуоресцентный белок (jellyfish green fluorescent protein)
ПД - плазмодесма
ТБ - транспортный белок
ЭР - эндоплазматический ретикулум
ТРПС - тРНК-подобная структура
оц-кДНК - одноцепочечная кДНК
дц-кДНК - двухцепочечная кДНК
п.н. - пара нуклеотидов
т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ПААТ - полиакриламидный гель
ДСН -додецилсульфат натрия
ДТТ - дитиотрейтол
ИПТГ - изопропил-Р-Э-тиогалактозид
ТЕМЕД - N,N,N ’ ,N’ -тетраметилэтилендиамин
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
X-gal - 5-бромо-4-хлор-3-индолил-р-В-галактозид

конструирование химерного ТБ (ТБг.ЗФБ) слитого с зеленым флуоресцентным белком (ЗФБ) - низкомолекулярным белком, обнаруженным у медузы, флуоресцирующим зеленым при облучении синим светом, позволило изучать флуоресцентной микроскопией динамику синтеза и движения ТБ in vivo (Reichel and Beachy, 1998). Параллельно использовался модифицированный зеленый флуоресцентный белок (эрЗФБ), избирательно связывающийся с мембранами ЭР и позволяющий наблюдать изменения структуры ЭР in vivo той же флуоресцентной микроскопией (Reichel and Beachy, 1998).
На самых ранних этапах инфекции ТБ::ЗФБ обнаруживается в перинуклеарной области и быстро распространяется по ЭР, вызывая его агрегацию, по-видимому, за счет превращения гладкого ЭР в шероховатый ЭР, являющийся белок-синтезирующей структурой. В крупных агрегатах выявляется как ТБ::ЗФБ, так и эрЗФБ. Биохимические исследования показали связь ТБ с микросомной фракцией (обломками шероховатого ЭР), где он входит в структуру мембраны, локализуясь на внешней стороне (Reichel and Beachy, 1998). Образующиеся агрегаты, по-видимому, являются структурами, обеспечивающими максимальный синтез вирусных компонентов. На более поздних этапах инфекции агрегаты рассасываются, восстанавливая обычную структуру ЭР. При этом ТБ уже не обнаруживается в составе ЭР, а оказывается связанньм с цитоскелетом (Reichel and Beachy, 1998). Значение этого последнего факта может быть двояким: с одной стороны, цитоскелет может выводить ТБ из агрегатов, тем самым, восстанавливая структуру ЭР и предотвращая гибель клеток, а с другой — может транспортировать ТБ к клеточной стенке и ПД. В этой связи уместно вспомнить об участии цитоскелета в транспорте мРНК (De Franco et al., 1998). Можно предположить, что транспорт вирусной РНК и модификатора плазмодесмы - транспортного белка к плазмодесме происходят совместно.
2.3.4. Механизм межклеточного транспорта ВТМ.
Вызываемое транспортным белком ВТМ увеличение проницаемости ПД, хотя и значительно (от 0.73 нм до 4.3 нм), все же не способно обеспечить транспорт ВТМ как в виде собранных вирионов (18 х 300 нм), так и в виде свободной вирусной РНК (10 нм).
Установлено, что in vitro ЗОК-белок формирует с однонитевыми нуклеиновыми