Изучение свойств растительной триптофанрацемазы и ее роли при прорастании и осмотическом стрессе

• Автор: Копытина, Татьяна Васильевна
• Шифр специальности: 03.00.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Иркутск
• Количество страниц: 152 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1Л Зеркальная изомерия в природе
1Л Л Стереоконфигурация природных и синтетических органических веществ

1 Л.2 Природные О-аминокислоты. Встречаемость и предполагаемая
физиологическая роль
1.2. Биохимическая характеристика рацемаз
1.2.1. Рацемазы - пиридоксальфосфатзависимые ферменты
1.2.2. Структура, свойства и особенности функционирования активных центров
в зависимости от осмотичности среды
1.3 Общие сведения о рацемазах
1.3.1. Жизненно важная роль рацемаз у бактерий
1.3.2 Сведения о рацемизации аминокислот в клетках животных и человека
1.3.3. Свидетельства функционирования рацемаз в растительных клетках
1.4. Участие триптофанрацемазы в биосинтезе ИУК у растений в различных физиологических состояниях
1.4.1. Присутствие В-аминокислот и В-триптофана, а также конъюгатов в семенах и проростках как свидетельство рацемизации
1.4.2. Адаптации растений к осмотическому стрессу. Индукция образования В-триптофана и малонил-В-триптофана при осмотическом стрессе и завядании
1.4.3. Снабжение субстратом В-триптофанаминотрансферазы
1.5. Системы переноса растительных генов
1.5.1. Экспрессирующие фаговые и бактериальные векторы
2. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1 .Объекты исследований
3.1.1. Растительные объекты исследований

3.1.2. Бактериальные штаммы для клонирования в фаге 11
3.1.3. Условия выращивания растительного материала
3.1.4. Условия культивирования бактериальных штаммов
3.2. Получение и фракционирование ферментного препарата триптофанрацемазы
3.2.1. Выделение триптофанрацемазы
3.2.2. Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе
3.2.3. Хроматография на О-триптофан-агарозе
3.2.4. Определение активности триптофанрацемазы
3.3. Определение кинетических параметров рацемазы
3.4. Определение молекулярной массы триптофанрацемазы
3.4.1. Электрофоретическое разделение в ПААТ
3.4.2. Гельфильтрация
3.6.Получение антисыворотки на триптофанрацемазу
3.5.1. Иммунодиффузия в геле
3.6. Скрининг библиотеки кДНК с антителами на триптофанрацемазу
3.6.1. Получение фаговых бляшек на бактериальном газоне
3.6.2. Проведение гибридизационного скрининга
3.7. Анализ рекомбинантных клонов, несущих кДНК пшеницы
3.7.1. Выращивание фаговых векторов
3.7.2. Выделение фаговой ДНК
3.7.3. Выделение плазмидной ДНК
3.7.4. Гидролиз ДНК рестриктазами
3.7.6
3.8. Статистическая обработка данных
3.11. Используемые реактивы и материалы
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Изучение активности триптофанрацемазы в динамике роста проростков пшеницы

4.1.1. Влияние повышенной осмотической концентрации на активность триптофанрацемазы из пшеницы и томатов
4.1.3. Получение синтетических N -мал онил-Ь-три гттофана и М-малонил-О-триптофана и изучение их способности к рацемизации
4.1.4. Активность триптофанрацемазы в различных сортах и гибридах пшеницы
4.2. Оптимизация условий выделения и фракционирование триптофанрацемазы
4.2.1. Влияние ингибиторов протеаз и глицерина на активность триптофанрацемазы
4.2.2. Влияние ПЛФ на активность триптофанрацемазы
4.2.3. Влияние фракционирования с помощью ионно-обменной и аффинной хроматографии на активность триптофанрацемазы
4.3. Активность триптофанрацемазы из проростков томатов
4.4. Определение субстратной специфичности триптофанрацемазы
4.4. 1. Сравнительный аминокислотный состав проростков пшеницы
4.4.2. Определение кинетических свойств триптофанрацемазы
4.5. Определение молекулярной массы триптофанрацемазы
4.5.1. Электрофоретическое разделение в ПААГ
4.5.3. Гельфильтрация на Молселекте Г
4.4. Иммунологический анализ антител к триптофанрацемазе из проростков пшеницы, полученных в сыворотке кролика
4.4.1. Оценка иммунологического сродства антител к цитозольной и
этиопластной триптофанрацемазе
4.7. Анализ рекомбинантных клонов фага АН 1, выявивших иммунопозитивную реакцию с антителами на триптофанрацемазу
4.7.1. Рестрикционный анализ ДНК из рекомбинантов /ЦД11
4.7.2. ПЦР-амплификация кДНК пшеницы в фаге
4.7.3. Лизогенизация клеток Е.соИ У1089

stearothermophilus является термостабильным ферментом и способна сохранять активность при 55°С. Это свойство фермента обеспечивало устойчивость бактериальных клеток к повышенным температурам (Inagaki, Tanizawa et al., 1986). Предполагают, что термостабильность аланинрацемазы из В. Stearothermophilus обусловлена жестким ковалентным связыванием пиридоксальфосфата в активном центре фермента (1 моль пиридоксальфосфата на 1 моль фермента), удаление которого из активного центра возможно только при кипячении в щелочи (Toyama et al., 1991). Восстановить аланинрацемазную активность удавалось лишь частично при внесении экзогенного пиридоксальфосфата.
В работе Н.И. Рекославской и др. (1995) было показано, что аланинрацемаза из E.coli штамм XLl-Blue ("Stratagene”, США) также является термостабильным ферментом. Сопряжение трех ферментативных реакций -аланинрацемазной, аминооксидазной и лактатдегидрогеназной позволило авторам развить быстрый и надежный метод определения ферментативной активности с возможностью проведения серийных анализов (схема 8).
L-Аланин О-Аланин
—*- Пируват + NADH Лактат + NAD+.
Схема
Реакция 1 оказалась совместимой с реакцией 2 и поэтому совместная инкубация двух ферментов предотвратила обратную реакцию рацемизации и способствовала накоплению пирувата в инкубационной среде. Сравнение активности аланинрацемазы в препаратах перед термообработкой и после нее показало, что удельная активность аланирацемазы возрастает почти в 10 раз / после прогревания при 70°С. В дальнейшем кипячение белкового раствора после соникации было использовано как этап очистки этого фермента. С другой стороны, удаление большинства термолабильных белков в начале этапа выделения аланинрацемазы позволило избавиться от малоустойчивых к