Физиология криоустойчивости и криосохранения культивируемых in vitro клеточных штаммов растений

• Автор: Попов, Александр Сергеевич
• Шифр специальности: 03.00.12
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 346 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
1. ВВОДНАЯ ГЛАВА
1.1. Актуальность работы
1.2. История проблемы криохранения генофонда
1.3. Особенности криосохранения культивируемых клеток растений- II
1.4. Цели и задачи исследования
1.5. Научная новизна работы
1.6. Практическое значение исследования
1.7. Апробация работы
2. ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ:
ОСНОВНЫЕ МЕХАНИЗМЫ КРИОПОВРЕЖДЕНИЯ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ
2.1. Образование льда
2.2. Влияние solution effects
2.3. Обезвоживание клеток и илазмалемма - 32.
3. ГЛАВА 3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ:
КРИОСОХРАНЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ШТАММОВ РАСТЕНИЙ
3.1. Поиски подходов к решению проблемы
3.2. Процедура криосохранения
р. О Т
• К_| _!_
3.2.2. Обор и концентрирование клеточной культуры
3.2.3. Криозащита у

5.4.1. Программное замораживание
3.2.4.2. Упрощенные способы замораживания
3.2.4.3. Витрификация
3.2.5. Хранение
3.2.6. Оттаивание
3.2.7. Возобновление роста клеток - рекультивирование
3.2.8. Характеристики восстановленных клеточных культур
л.-l. Специальное предварительное культивирование (pregrowth)
4 9.4. Глубокое замораживание
3.2, И Т Птмтппяммттпе оямптяттсятлд
ГЛАВА 4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ:
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты
Методы
ГЛАВА 5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ: РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ-ЮЗ Исследование физиологического состояния клеточных культур
1. Физиологические особенности культуры клеток моркови
2. Суспензионные культуры клеток диоскореи дельтовидной
3. Каллусные клеточные культуры диоскорей
кавказской и балканской
4. Суспензионные культуры клеток женьшеней Pcincrc ginseng,
P. quinquefolius (американского), P. Japonicus
Влияние криопротекторов на выживаемость
I. Дополнительная криозащита клеток моркови
Действие специального предварительного культивирования (подготовка к криосохранению)
1. Закаливание суспензионных клеточных культур
2. Снижение водного потенциала питательной среды
3. Эффект пролина и других антистрессовых аминокислот
4. Влияние краткой инкубации при пониженной температуре -160 Исследования крио- и осмоустойчивости плазмалеммы
клеток растений In vitro
1= Флуориметрический метод определения деструкций
плазмалеммы
2, Повреждения плазмалеммы клеток диоскореи при замораживании-оттаивании и эквиосмотическом сжатии
3. Повреждения плазмалеммы клеток женьшеня при замораживании-оттаивании и эквиосмотическом сжатии
5.4.4. Влияние глубокого замораживания на Кг-стимулируемую М£2+-зависимую Н+-АТФазу плазмалеммы клеток женьшеня штамма Ж
5.4.4.1. Модификация метода выделения везикул плазмалеммы
для культивируемых клеток женьшеня штамма Ж
5.4.4.2. Активность K+-, Mg2+-, Н+-АТФазы плазмалеммы контрольной и закаленной культур клеток женьшеня
штамма Ж-2 до и после глубокого замораживания
5.5. Значение скорости замораживания и процессов льдообразования в растворе криопротекторов для выживаемости клеток
5.5.1. Изучение процессов кристаллизации криозащитных растворов
5.5.2. Обеспечение плавного обезвоживания клеток при
инициации кристаллизации
5.6. Исследование восстановления клеточных и тканевых
культур после оттаивания из жидкого азота
5.6.1. Оттаивание
5.6.2. Изучение концентрационных градиентов при удалении криопротекторов и рекультивировании клеток
5.6.3. Физиологические, цитологические и биохимические характеристики клеточных культур, восстановленных
после длительного хранения в жидком азоте
5.7. Регенерация растений после криохранения
их клеточных культур
6. ГЛАВА 6. АНАЛИЗ ПОЛУЧЕННЫХ ДАННЫХ И РАЗРАБОТКА КОНЦЕПЦИИ
КРМОУСТОЙЧИВОСТИ (ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ)
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА
Стеш) в виде везикул, ке связанных с плазмалеммой. Это показано как световой микроскопией с окраской флуоресцеїном, конъюгированном с конканавалином А, так и электронной микроскошей Е Steponkus Р.» Wolfe J. et al., 1981; Gordon-Kanro W., steponkus P., 1984 а,Ъ; Steponkus P., Dowgert M. et al., 1983 ], При оттаивании происходит разбавление окружающего раствора, расширение протопластов и встраивание в плазмалемму вышедшего из нее материала, Однако обратимость процесса неполная, что и приводит к лизису части протопластов. Каждый вид и сорт характеризуются определенным максимально возможным приростом площади поверхности, например, для 50% незакаленных протопластов ржи сорта Рыта эта величина не более 1122+192 жмс и превышается при оттаивании после замораживания ниже -5°0 (ЛТсП5 [ Steponkus Р., 198-4; Dowgert М., Steponkus Р., 1984 ].
Максимально возможный прирост увеличивается вдвое (до 2180 мкм" при сжатии незакаленных протопластов в растворах прелина (до 2 осмолей), причем имеется зависимость от времени экспозиций в пролине в сжатом состоянии. Следовательно, пролин влияет на плазмалемму исследуемых клеток во время сжатия Е Liu Y.-L., Steponkus P., 1983 а ], что может объяснить часть его криозащитных свойств, Защитное влияние на прирост поверхности плазмалеммы при расширении протопластов после сжатия Вист и Степонкус наблюдали и в случае сахаров и сахарных спиртов Е Wiest S., Steponkus P., 1978; Степонкус П.Л., Вист С,K., 1983 ], криопротекторные свойства которых общеизвестны. Показано, что и один из наиболее мощных криопротекторов ДМСО влияет на стабильность, состав, состояние и проницаемость мембран как искусственных [ Lyman G., Papahadopoulos D. et al
1976 ], так и плазмалеммы клеток животных I Mlronescu S., 1977 ] и растений Е Haydu Z., Lasar G. et al., 1977; Delmer, 1979; Erdei L. Yign L. et al., 1982 3. Однако в основном криозащитное действие