Физическая и функциональная характеристика криптической плазмиды pPМ1 возбудителя мелиоидоза

• Автор: Захарова, Ирина Борисовна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Волгоград
• Количество страниц: 115 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Е ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ,
1.1 Плазмиды резистентности
1.2 Роль плазмид в биологии патогенных микроорганизмов
1.3 Некоторые аспекты изучения генетики и естественной изменчивости возбудителя мелиоидоза
1.4 Собственные плазмиды возбудителя мелиоидоза
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Бактериальные штаммы
2.2 Питательные среды и условия культивирования
2.3 Выделение ДНК
2.4 Ферментативные реакции
2.5 Трансформация клеток E.coli
2.6 Методы электрофореза
2.7 Иммунохимические методы
2.8 ДНК'ДНК гибридизация
2.9 Получение препаратов клеточных мембран
2.10 Определение размеров рестрикционных фрагментов
3. ФИЗИЧЕСКОЕ КАРТИРОВАНИЕ КРИПТИЧЕСКОЙ ПЛАЗМИДЫ рРМ1 ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА
3.1 Рестрикционный анализ нативной рРМ1
3.2 Рестрикционный анализ фрагментов рРМ1, клонированных на мультикопийных векторах pBR322 и pUC19
3.3 Построение рестрикционной карты рРМ1
4.ГИБРИДИЗАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ рРМ1
4.1 .Изучение гомологии ДНК рРМ1 с геномными ДНК
В.pseudomallei, близкородственных и гетерологичных видов
микроорганизмов
4.2.Изучение гомологии ДНК критической плазмиды рРМ1и фагов

возбудителя мелиоидоза
5. КЛОНИРОВАНИЕ pPMl В ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ СИСТЕМАХ
5.1 Конструирование интегративного вектора на основе ColEl репликона для клонирования в B.pseudomallei
5.2 Локализация области начала репликации pPMl
5.3 Получение библиотеки pPMl
5.4 Клонирование Крп 1-фрагментов pPMl
5.5 Анализ продуктов экспрессии рекомбинантных плазмид
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ДСН (БОБ) додецилсульфат натрия
ИПТГ изопропилтио- р -О-галактозид
ИФА иммуноферментный анализ
м.к. микробные клетки
МІЖ минимальная подавляющая концентрация
ІІМ наружные мембраны
ПА АГ полиакриламидный гель
ПДРФ полиморфизм длин рестрикционных фрагментов
т.п.н тысяча пар нуклеотидов
ФСБ фосфатно-солевой буфер
кОа килодальтон
МОа мегадальтон
Мг - относительная молекулярная масса
ХОаІ 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-Р -О-галактозид

Бульонные культуры выращивали в течение 16-18 ч при 37°С с интенсивной аэрацией, агаровые - при 37°С в течение 1 сут.
При необходимости в качестве селективных агентов в среды добавляли антибиотики: ампициллин (25 - 50 мкг/мл), тетрациклин (15-20 мкг/мл) и стрептомицин (50-100 мкг/мл).
2.3 Выделение ДНК
Препаративное выделение плазмидных ДНК В.рзеиВота/ка
Плазмидные ДНК выделяли но методу С.Кабо, Б.ТХш (143) с нашими модификациями. Из свежей суточной агаровой культуры готовили суспензию в питательном бульоне ("Ойсо") плотностью 109 м.к./мл и высевали по 0,1 мл на чашку с ВН1-агаром ("1)г1со"). Посевы выращивали при 37°С в течении 16-18 ч. Бактериальную массу смывали 10 мл буфера ТЕ, pH 8,0. Тщательно ресуспендировали клетки и суспензию по каплям вносили в 200 мл лизирующего раствора: 100 мМ трис-НС1, 50 мМ ЭДТА, 2% ДСН; (pH доводили до 12,5 свежим раствором 2М ИаОН). Лизис проводили на магнитной мешалке со скоростью вращения 50 об/мин в течение 10 мин. Лизированную культуру прогревали 1 ч. при 65°С, охлаждали до комнатной температуры. В лизат по каплям вносили 200 мл смеси фенол - хлороформ (1:1) и оставляли до разделения фаз. К водной фазе добавляли равный объем смеси хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1), тщательно перемешивали и вновь отбирали водную фазу. ДНК концентрировали переосаждением охлажденным этанолом (2,5 объема) в присутствии 0,ЗМ ацетата натрия. Осадок высушивали, растворяли в бидистиллированной воде. Полученный препарат ДНК подвергали дополнительной очистке путем центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия в присутствии бромистого этидиума при 40 000 об/мин, 15°С, 48ч (70.1 .Тт). Нижнюю по-