Роль компонентов системы транспорта глюкозы в проявлении физиологических свойств бактерий рода Erwinia

• Автор: Даценко, Кирилл Александрович
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 128 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Структура и функции ФТС у энтеробактерий
1.2. Общие компоненты ФТС
1.2.1. Фермент I
1.2.2. Белок НРг
1.3. Генетика ФТС. Регуляция синтеза общих и 11 субстратспецифичных компонентов ФТС
1.3.1. Специфические компоненты
1.3.2. р!з-оперон
1.4. Свойства мутантов энтеробактерий, дефектных по 15 компонентам ФТС
1.5. Участие белков ФТС в регуляции физиологических процессов 15 бактериальной клетки
1.5.1. ФТС и явление «исключение индуктора»
1.5.2. Роль компонентов ФТС в регуляции активности 18 аденилатциклазы
1.5.3. Роль ФТС в регуляции генной активности
1.6. ФТС бактерий рода Етпйа
1.7. Пектолитические ферменты бактерий рода Епунна
1.7.1. Генетический контроль синтеза пектолитических ферментов 25 Епуйпа
1.7.2. Регуляция синтеза пектатлиаз у Егтоша
1.8. Целлюлолитические ферменты и регуляция их синтеза у 28 бактерий рода Етипа
Глава 2. Общая характеристика объектов и методов исследования Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЗЛ. Получение и характеристика pts-мутантов бактерий рода Erwinia
3 Л Л. Выделение мутантов бактерий рода Erwinia с нарушением утилизации глюкозы
ЗЛ .2. Утилизация углеводов у выделенных glu'- мутантов
ЗЛ.3. Скорость транспорта ФТС-углеводов у выделенных мутантов
бактерий рода Erwinia
3.2. Устойчивость продукции пектолитических ферментов к катаболитной репрессии глюкозой
3.3. Клонирование pts-генов бактерий рода Erwinia
3.3.1. Клонирование pts-генов бактерий Е. chrysanthemi и Е. atroseptica
3.3.2. Клонирование гена ptsl бактерий рода Erwinia in vivo
3.3.3. Экспрессия ptsl-генов в гомо- и гетерологичных системах
3.3.4. Клонирование reHaptsH
3.3.5. Клонирование генаЕ. chrysanthemi, комплементирующего мутацию в штамме 052. Идентификация мутации
3.4. Картирование генов ptsl и ptsH Е. chrysanthemi
3.5. Активность ферментов у транспортных мутантов бактерий Е. chrysanthemi и Е. atroseptica
3.5.1. Синтез Р-галактозидазы у штаммов Е. chrysanthemi и Е. atroseptica, дефектных по общим компонентам ФТС
3.5.2. Внутриклеточная концентрация цАМФ у транспортных мутантов бактерий рода Erwinia
3.5.3. Влияние pts-мутаций на продукцию внеклеточных ферментов бактериями Е. chrysanthemi и Е. atroseptica
3.5.3.1. Влияние мутаций ptsl и ptsH на продукцию пектатлиаз бактериями рода Erwinia
3.5.3.2. Влияние мутаций ptsl и ptsH на динамику синтеза пектатлиазы у Erwinia
3.5.3.3. Регуляция синтеза изоферментов пектатлиаз
3.5.3.4. Целлюлолитическая активность ptsl-мутантов
3.5.3.5.Изучение патогенных свойств pts-мутантов бактерий Е. atroseptica в системе «бактерия - растение-хозяин»
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Электрофоретический анализ белков. Электрофоретический анализ очищенных концентрированных препаратов различных пектатлиаз проводили в 7% полиакриламидном геле в кислой системе (14). В качестве электродного буфера использовали 0.033 М Ь-гистидин-ацетат, pH 5.5, предварительно охлажденный до +4°С. Электрофорез проводили в трубках с внутренним диаметром 6 мм и длиной 10 см в течение 5 часов при силе тока 5 мА на трубку с использованием в качестве маркерного красителя метиленового синего. Один образец наносили на несколько трубок, затем, после получасового окрашивания 0.04% кумасси 0-250 в 3.5% хлорной кислоте одного из гелей, остальные неокрашенные гели разрезали и из участков, соответствующих окрашенным белковым полосам, элюировали ферменты 0.05 М трис-НС1-буфером, pH 8.5, в течение 24 часов при +4°С. В электрофоретических элюатах определяли ферментативную активность (в Е/мл) и, учитывая объем элюатов, рассчитывали количество каждого изофермента.
Электрофоретический анализ ДНК. Выявление плазмидной ДНК проводилось по модифицированному методу (56). Примерно 108 клеток снимали стерильной зубочисткой с поверхности агаризованной среды и суспендировали в 20 мкл 20% фиколла 400, содержащего 0.5 мг/мл лизоцима, 10 мкг/мл РНК-азы и 0.05% бромфенолового синего, нанесенного на поверхность 0.8% агарозного геля в стеклянной трубке диаметром 4-6 мм. Через 5-10 мин добавляли 25 мкл 10% фиколла, содержащего 0.2% додецилсульфата натрия, слегка перемешивали концом зубочистки и сверху наносили (без перемешивания) 50 мкл 5% фиколла с 0.2% додецилсульфата натрия. Затем на поверхность смеси наслаивали расплавленную 0.8% агарозу, охлажденную до 45-50° С. После застывания агарозы трубки помещались в прибор ПЭФА-1 и подвергали элекрофорезу в трис-боратном буфере в следующем режиме: 45 мин при 0.5 мА на трубку и 2-2.5 часа при
2.5 мА на трубку (до выхода бромфенолового синего в нижний электродный