Разработка технологии производства антигена Coxiella burnetii для реакции связывания комплемента, метода флуоресцирующих антител и иммунофлуориметрического анализа

• Автор: Соснина, Оксана Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Пермь
• Количество страниц: 149 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИИ
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНОВ Coxiella burnetii И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы исследования
2.1.1. Микроорганизмы
2.1.2. Антигены
2.1.3. Сыворотки
2.2. Методы исследования
2.2.1. Реакция связывания комплемента
2.2.2. Реакция угнетения связывания комплемента
2.2.3. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)
2.2.4. Реакция нейтрализации антигена (РНАг)
2.2.5. Метод флуоресцирующих антител (МФА)
2.2.6. Иммунофлуориметрический анализ (ИФМА)
2.2.7. Электрофорез в полиакриламидном геле
2.2.8. Колоночная гель хроматография антигена
2.2.9. Люминесцентная микроскопия
2.2.10. Электронная микроскопия
2.2.11. Определение белка
2.2.12. Стандартизация C.burnetii
2.2.13. Расчет необходимой площади поверхности мембран
2.2.14. Статистическая обработка
Глава 3. РАЗРАБОТКА СПОСОБА ВЫДЕЛЕНИЯ КОРПУСКУЛЯРНОГО АНТИГЕНА Coxiella burnetii ШТАММА «М-44», ПРИГОДНОГО ДЛЯ РАЗЛИЧНЫХ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ (РСК, нМФА)
3.1. Апробация различных способов препаративного выделения корпускулярного антигена C.burnetii и выбор оптимального метода
3.1.1. Получение антигена методом эфирной обработки по М.Ю.Морозовой и его оценка в различных серологических тестах
3.1.2. Выделение антигена по способу В.А.Яблонской и его серологическая характеристика
3.1.3. Очистка C.burnetii методом дифференциального центрифугирования и оценка пригодности полученного антигена для РСК, нМФА

3.1.4. Сравнительная оценка апробированных способов очистки
3.2. Разработка способа очистки C.burnetii с использованием дифференциального центрифугирования, ферментолиза и микрофильтрации

3.2.1. Стабилизация основных антигенных структур на C.burnetii, штамма «М-44»
3.2.2. Максимальная изоляция C.burnetii из клеток желточной оболочки: гомогенизация и протеолиз трипсином
3.2.3. Изучение возможности использования микрофильтрации для очистки антигена. Выбор мембран
3.2.4. Отработка оптимальных параметров микрофильтрации субстрата
C.burnetii
3.2.5. Определение характеристик препарата с помощью метода электронной микроскопии и колоночной гель-хроматографии
3.2.6. Получение антигенов C.burnetii и изучение специфической активности приготовленных антигенов C.burnetii в нескольких серологических реакциях и их стандартизация
3.2.7. Стабилизация антигенов C.burnetii
Глава 4. ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ДАЛЬНЕЙШЕГО ПРИМЕНЕНИЯ РАЗРАБОТАННОГО АНТИГЕНА С.burnetii
4.1. Исследования в области применения антигена C.burnetii для получения диагностических сывороток
4.2. Изучение возможности использования антигенов C.burnetii для выявления антител в ИФМА
4.2.1.Приготовление для оценки антигенов Eu-конъюгатов для прямого и непрямого вариантов ИФМА
4.2.2. Изучение сорбционной способности антигенов на твердофазном носителе
4.2.3. Выявление специфических антител в непрямом ИФМА
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.
АЕ - антигенные единицы
«ЖМ-JIyra» - штамм "Желтогордая Мышь-Луга"
ЗФР - забуференный физиологический раствор
ИФРМА - иммунофлуоресцентная реакция микроагглютинации
ИФА - иммуноферментный анализ
ИФМА - иммунофлуориметрический анализ
нИФМА - непрямой иммунофлуориметрический анализ
ИФМ - иммунофлуоресцентный метод
ИЭД - иммуноглобулиновый эритроцитарный диагностикум
КАП - кожная аллергическая проба
КЭ - куриные эмбрионы
ЛАТ - люминесцирующие антитела
ЛИС - липополисахарид
НКС - нормальная кроличья сыворотка
нМФА - непрямой метод флуоресцирующих антител
пМФА - прямой метод флуоресцирующих антител
ПААГ - полиакриламидный гель
РА - реакция агглютинации
РМА - реакция микроагглютинации
РИГА - реакция непрямой гемагглютинации
РНАг - реакция нейтрализации антигена
РСК - реакция связывания комплемента
РУСК - реакция угнетения связывания комплемента
ФИТЦ - флуоресцина изотиоцианат
ЧАЭД - человеческий антигенный эритроцитарный диагностикум
Ig G - иммуноглобулины класса G

0,2 мл полных антител в рабочем разведении, соответствующем двукратному титру. Содержимое пробирок перемешивали встряхиванием и инкубировали при температуре (37±1)°С в течение 1 часа. Гемолитическую систему добавляли в объеме 0,4 мл. Результаты учитывали через 1 час по четырехкрестовой шкале. За положительные результаты реакции принимали полный гемолиз или задержку гемолиза не более, чем на два креста. Правильность постановки реакции проверяли общепринятыми контролями.
2.2.3. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)
Выявление антивидовых антител осуществляли с помощью РНГА, рекомендованной П.С.Барбаном с сотр.[9].
Реакцию ставили с 1%-ной взвесью формалинизированных и танизированных эритроцитов барана, сенсибилизированных
инактивированными 10 человека (ЧАЭД). РНГА проводили в общем объеме 0,075 мл (микрометод) в 96-луночных планшетах для иммунологических исследований. В лунках планшетов готовили ряд последовательных двукратных разведений (с 1:50 до 1:51200) антивидовых сывороток или их иммуноглобулинов в объеме 0,05 мл. Затем в каждую лунку добавляли по 0,025 мл 1%-ной взвеси ЧАЭД. Содержимое лунок перемешивали встряхиванием и оставляли на 1-2 часа при температуре 18-20°С, после чего учитывали результат.
Учет результатов реакции проводили по степени агглютинации эритроцитов, которую оценивали по общепринятой четырехкрестовой системе. Титром сыворотки (иммуноглобулинов) считали то максимальное ее разведение, которое еще вызывает агглютинацию ЧАЭД не ниже, чем на три креста.
РНГА для определения антигена
Постановку РНГА осуществляли по методике П.С.Барбана и А.В.Мисенжникова [8]. Для выявления титра иммуноглобулина человека в процессе иммуносорбции на геле гидрокиси алюминия готовили антивидовой