Исследование взаимодействия между бактериальными ФМН-редуктазой и люциферазой

• Автор: Мажуль, Михаил Михайлович
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 141 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
I. БИОЛОГИЯ ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ БАКТЕРИЙ
1.1. Общие полжения, таксономия, физиология
1.2. Рост и развитие культура люминесцентных бактерий..*
1.3. Потребность в кислороде и энергетика
2. ЛЮМИНЕСЦЕТНАЯ СИСТЕМА СВЕТЯЩИХСЯ БАКТЕРИИ
2.1. Субстрата лвдиферазной реакции, ее квантовый
выход
2.2. Применяемые способы измерения активности
лвдиферазн
2.3. Строение фермента
2.4 Стадии лвдиферазной реакции, ее интермедиата
и цути их превращения
2.5. Гены и генная организация lux оперонов люминесцентных бактерий
2.6. Электроннотранспортные цепи люминесцентных
бактерий
2.7. Р1Ш-редуктаза (NAD(Р)Н:PMN-оксвдоредуктаза)
2.8. Компдексообразование между РШ-редуктазой
и лщиферазой

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3. МАТЕРИАЛЫ.
3.1. Состав среда и условия роста люминесцентных
бактерий
3.2. Зависимость свечения бактерий от стадий роста
1.3. Состав среда и условия роста нелшинесцирующих бактерий
3.4. Реактивы
4. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
4.1. Измерение активности ферментов
а) Лвдефераза
б) FMN-редуктаза
в) NADH:цитохром с-оксидороедуктаза
4.2. Электрофорез в ПААТ
4.3. Нахождение изоэлектрической точки
4.4. Определение молекулярной массы ферментов
4.5. Определение белка
4.6. Измерение спектров биолюминесценции
5. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ФЕРМЕНТОВ
5.1. Получение бактериальной сульфатаммонийной пасты
5.2. Выделение РМЫ-редуктазы из Y.fiacherl
5.3. Очистка люциферазы из V.fischeri
5.4. Выделение PMN-редуктазы из E.coli
5.5. Выделение обоих ферментов из рекомбинантного
штамма E.coli «М109 (рРЗ)

6.СВОЙСТВА FMN-РЕДУКТАЗ
6.1. Свойства FMN-редуктазы из V.fiachert
6.2. Свойства FMN-редуктазы из E.coli
7. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЛЮЦИФЕРАЗЫ И МЮ-РЕДУКТАЗЫ
7.1. Ферменты из V.fiacfwri
7.2. Ферменты из V.lwrveyi и P.phosphorevm
7.3. Лящифераза из E.coli JMl09(pF3) с генами Im AB
7.4. Фермента из E.coli JM109, E.coli JMi09(pF3)
и V. fi acher i
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
ЦИТИРУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

обнаружено энзиматически (а впоследствии были выделены и идивидуальные белки) в различных организмах - от бактерий до человека, включая такие люминесцентные бактерии, как V.fischeri, V .harveyl и P. phosphor тт. Что касается PMN-редуктаз из бактерий, то данные по их субстратной специфичности, кинетическим константам, молекулярной массе и т.д. столь отличаются у различных исследователей, что возникает вопрос, об одном ли и том же ферменте идет речь.
При анализе данных по литературе о свойствах РМЫ-редуктаз из люминесцентных бактерий видно, что в ряде случаев исследователям не удавалось получить ферменты с чистотой более 20%, а методы аффинной хроматографии для PMN-редуктазы из V.fischeri оказались вообще неэффективными (Duan, Hastings, 1975; Gerlo, Charlier, 1975; Jablonski, DeLuca,1977; Watanabe, Hastings, 1982 и т.д.). Возможно, следствием этого являются большие расхождения в данных по степени очистки, молекулярной массе, удельной активности с субстратами и акцепторами. Так при изучении PMN-редуктазы из V.fischeri сообщено о молекулярной массе 43 кДа и удельной активности с NADH 50 мкмоль/мин на I мг белка (Duan, Hastings, 1975). Близкая величина в 45 кДа сообщена в другой работе (Jablonski, DeLuoa,1977). Вместе с тем, тоже и Мишельсон (Puger, Miohelson, 1972) обнаружили PMN-редуктазу с молекулярной массой 23 кДа и удельной активностью с NADH, равной 0.14 мкмоль/мин на I мг белка. В более поздних исследованиях (Мажуль, Данилов, 1994) приводится близкая этой масса - 24,5 кДа. Большое разнообразие параметров характерно и для более изученных PMN-редуктаз из других люминесцентных бактерий V.harveyt, где молекулярная масса определена от 19 (Gerlo,