Изучение транспорта Ti-плазмида pGV3850 из Agrobacterium tumefaciens в Escherichia coli

• Автор: Великов, Владимир Александрович
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 112 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНРІЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Взаимоотношения фитопатогенных агробактерий с растениями
1.1.1. “Генетическая колонизация”
1.1.2. Структурно-функциональная организация Ті-плазмид
1.2. Гены коньюгационного переноса Ті-плазмид и регуляция
их экспрессии
1.2.1. Перенос Ті-плазмид при конъюгации бактерий
1.2.2. Организация генов коньюгационного переноса Ті-плазмид
1.2.3. Экспрессия генов коньюгационного переноса Ті-плазмид
1.2.4. Гомология системы коньюгационного переноса Ті-плазмид
с другими системами
1.3. Хромосомные гены вирулентности агробактерий
1.3.1. Хромосомные мутации, влияющие на патогенность микроорганизма
1.3.2. Сходство ранних этапов взаимодействия Agrobacterium и Rhizobium с растениями
1.4. Ті- и Ri-плазмидные гены вирулентности агробактерий и регуляция их экспрессии
1.4.1. Организация v/V-генов Ті-плазмид
1.4.2. Экспрессия vp-генов Ті-плазмид
1.5. Процессинг Т-ДНК в бактериальной клетке и ее перенос в клетки растений
1.5.1. Формы процессированной Т-ДНК
1.5.2. Конъюгативная модель переноса Т-ДНК

1.6. Структурно-функциональное сходство vir- и тг-генов как доказательство конъюгативной модели
1.7. Взаимодействие систем переноса ДНК Ti-плазмид
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы
2.1.1. Оборудование
1.1.2. Реактивы и ферменты
2.1.3. Бактериальные штаммы и плазмиды
2.1.4. Растения
2.1.5. Среды, растворы
2.2. Методы
2.2.1. Проведение скрещиваний между Agrobacterium tumefaciens и Escherichia coli
2.2.2. Проведение скрещиваний в условиях, индуцирующих экспрессию v/r-генов
2.2.3. Анализ трансконъюгантов
2.2.4. Быстрое выделение небольших количеств плазмидной
ДНК методом щелочного лизиса
2.2.5. Модифицированный метод скрининга плазмид в геле
по Секару
2.2.6. Модифицированный метод выделения плазмидной ДНК
по Бирнбойму и Доли
2.2.7. Скрингинг плазмид в геле по Экхардту
2.2.8. Выделение тотальной ДНК из клеток E.coli
2.2.9. Приготовление компетентных клеток Е.coli и их трансформация препартами плазмидной ДНК
2.2.10. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля
2.2.11. Приготовление ДНК-зондов и и блот-гибридизация ДНК

2.2.12. Введение векторных плазмид в Erwinia carotovora и эксперименты по трансформации растений
2.2.13. Клонирование ДНК
РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Конъюгационный перенос Ti-плазмиды pGV3850 из Agrobacterium tumefaciens в Escherichia coli
3.2. Перенос Ti-плазмиды pGV3850 из Agrobacterium tumefaciens в Escherichia coli в условиях, индуцирующих экспрессию v/r-генов
3.3. Анализ трансконъюгантов
3.4. Рестрикционный и гибридизационный анализ плазмид, полученных при скрещиваниях в условиях экспрессии ы>-генов
3.5. Клонирование v/7-области Ti-плазмиды pGV3850
3.6. Введение v/r-генов Agrobacterium tumefaciens в Erwinia carotovora и использование эрвинии в экспериментах по трансформации растений
3.7. Способ предотвращения размножения клеток Agrobacterium и Erwinia на среде для культивирования трансформируемых тканей растений
3.8. Скрещивания штаммов Agrobacterium tumefaciens, содержащих плазмиды бинарной векторной системы трансформации растений, с Escherichia coli
ОБСУЖДЕНИЕ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА

бромфеноловый синий - Sigma, США; ксиленцианол - Sigma, США; лизоцим - Calbiochem, США; саркозил (N-lauroylsarcosine) - Sigma, США;
бакто-агар - Difco, США; бакто-триптон - Difco, США; дрожжевой экстракт - Difco, США.
Использовали следующие ферментативные препараты: РНКаза А, проназа Е, эндонуклеазы рестрикции отечественного производства и фирмы “Fermentas” (Латвия). При приготовлении ДНК-зондов использовали набор “DNA multiprime labellin system” (Amersham, Англия).
2.1.3. Бактериальные штаммы и плазмиды
Использованные в работе бактериальные штаммы и векторные плазмиды представлены в табл.2.
Таблица 2.
Бактериальные штаммы и плазмиды
Штаммы, плазмиды Характеристика Источник, ссылка
Escherichia coli:
НВ101 F-, hsdS20(rB- mB~), recA13, aral4, proA2, lacYl, galK2, rpsL20, xyl-5, mtl-1, supE44 Маниатис и др., 1984
ABI 157 F-, recA99, thr-1, leu-6, lacYl, galK2,ara-l 7,xyl-5, mtl-1,proA2, his-4, argE3, str-31, tsx-33 Маниатис и др., 1984
GM272-Sm F-,dam3,dcm6,hsdS21, (rK-mK-) lac Y1 ,tsx78,supE44,galK2,galR2 mtll, met Bl (thil tonA3ï) Маниатис и др., 1984
GJ23 RecA-мутант ABI 15; содержит плазмиды pGJ28 и R64drdl 1 Yan Haute et al., 1983