Биологические эффекты экзогенных бактериальных рибонуклеаз

• Автор: Ильинская, Ольга Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 213 с.

МИНИСТЕРСТВО ОБЩЕГО И ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
На правах рукописи
ИЛЬИНСКАЯ Ольга Николаевна
БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ЭКЗОГЕННЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ РИБОНУКЛЕАЗ
03.00.07- микробиология и 03.00.04 - биохимия
ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук
Научный консультант д.б.н., профессор, академик АН РТ И.Б.Лещинская
КАЗАНЬ

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
I. Рецепторные взаимодействия в сигнальной системе живой
клетки
1. Рецепторы клеток высших эукариот
2. Передача сигналов в клетках прокариот
И. Современные подходы к оценке генотоксичности соединений
1. Тестирование на мутагенность в бактериальных тест-системах
2. Тестирование на генотоксичность in vivo
3. Тестирование на генотоксичность в системе клеточных культур. 38 III. Разнонаправленные эффекты биологически активных веществ
1. Зависимость типа проявляемых эффектов от дозы эффектора
2. Регуляция функциональной активности клетки низкомолекулярными продуктами деградации естественных полимеров
3. Экзогенные рибонуклеазы как модуляторы клеточных функций
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Материалы
2. Методы определения жизнеспособности и функциональной
активности
2.1. Параметры роста микроорганизмов
2.2. Дыхание целых клеток и изолированных митохондрий
2.3. Цитотоксичность в культуре клеток

2.4. Нефротоксичность в системе изолированно перфузированой
почки
3. Методы определения генотоксичности
3.1. Тест на повреждение ДНК
3.2. Тест Эймса
3.3. Ага-тест
3.4. Тест на индукцию профага
3.5. SOS-хромотест
3.6. Тест на соматические мутации и рекомбинацию у Drosophila
3.7. Микроядерный тест
3.8. Тест на внеплановый синтез ДНК
3.9. Выявление двойных разрывов ДНК методом электрофореза в пульсирующем поле (PFGE)
4. Аналитические методы
4.1. Содержание белка
4.2. Содержание глюкозы
4.3. Активность ферментов
4.4. Выход нуклеотидов из клеток бактерий
4.5. Электрофоретическая подвижность микробных клеток
4.6. Электропроводность суспензии микробных клеток
4.7. Мембранный ток целой клетки и отдельных каналов (метод “patch clamp”)
5. Математическая обработка результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ РАБОТЫ
I. Биологические эффекты малых доз РНКаз
1 .Активирующее процессы жизнедеятельности влияние рибонуклеаз

иным дефектом в генах, ответственных за определенный путь репарации, по сравнению со штаммом дикого типа, позволяет судить об участии определенных компонентов репарационных путей в исправлении повреждений ДНК, вызываемых исследуемым соединением. Индукция SOS-функций клетки в ответ на действие генотоксикантов, измеряемая практически по активности фермента Р-галактозидазы, ген которого (lac Z) введен под контороль sfi А гена, входящего в SOS-оперон E.coli, позволяет судить о включении SOS-ответа в клетках тестерных бактерий [Quillardet, Hofnung, 1993]. Поскольку известно, что блокирование репликации вызывает определенный сигнал (вероятно, им является образование одноцепочечной ДНК), индуцирующий включение более чем 15 генов, многие из которых участвуют в репарации, можно предполагать, что индуцирующий SOS-ответ генотоксикант так или иначе приводит к образованию одноцепочечной ДНК. Превращение белка Rec А в протеазу, расщепляющую репрессор гена lex А и запускающую каскад реакций репарационного синтеза на поврежденной матрице, приводит к увеличению выживаемости клеток и повышению частоты мутаций, что дает возможность усилить генетическую вариабельность бактериальной популяции [Alberts et al., 1989]. В случае использования данной тест-системы не совсем корректно говорить об индукции генотоксикантом толковых мутаций, хотя, вероятнее всего, именно их накопление приводит к остановке репликации.
Известно, что выход профага из лизогенной культуры также находится под контролем гес А гена, поскольку протеаза Rec А действует на репрессоры отдельных профагов. В частности, протеазная активность Rec А была открыта на примере репрессора фага лямбда [Ptashne, 1986]. Поэтому система оценки мутагенного действия веществ, основанная на принципе фагоиндукции, также подразумевает индикацию включения