Сравнительные исследования панкреотических сериновых протеиназ гидробионтов Тихого океана

• Автор: Пивненко, Татьяна Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 307 с.

СОДЕРЖАНИЕ
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1, Эффективность действия сериновых протеиназ и их роль в регуляции белкового
обмена
1.1.1 .Строение активного центра и структура фермент-субстратаых комплексов
1.1.2. Регуляция белкового обмена и контроль протеолиза
1.2. Филогенетические аспекты взаимосвязи структуры и свойств сериновых протеиназ
1.3. Сериновые протеиназы рыб
1.3.1. Локализация и секреция
1.3.2. Выделение, молекулярные и каталитические свойства
1.4. Панкреатические сериновые протеиназы морских беспозвоночных
1.5. Общие свойства металлозависимых коллагенолитических протеиназ
1.6. Методы выделения сериновых протеиназ
1.6.1. Традиционные способы получения комплексных препаратов и индивидуальных ферментов
1.6.2. Аффинная хроматография и ее применение для выделения и исследования трипсина и химотрипсина
1.7. Иммобилизация и стабилизация ферментов
1.7.1. Модификация водорастворимыми полимерами
1.7.2. Иммобилизация на носителях смешанного типа
1.7.3. Стабилизация ферментов в водно-органических системах
1.7.4. Стабилизация в системах с твердыми фазами
1.7.5. Иммобилизованные ферменты как лекарственные средства
Экспериментальная часть Глава 2. Материалы и методы
2.1. Биологические материалы и реактивы
2.2. Методы анализа химического состава
2.3. Методы определения активности протеолитических ферментов

2.3.1. Определение активности с использованием растворимых белковых субстратов
2.3.2. Определение активности с использованием нерастворимых белковых субстратов
2.4. Определение эстеразной активности
2.5. Определение амидазной активности
2.6. Метод гель-фильтрации, определение молекулярной массы
2.7. Метод электрофореза, определение молекулярной массы
2.8. Ионообменная хроматография
2.9. Аффинная хроматография
2.10. Синтез аффинных сорбентов
2. 10.1. Активация сорбентов с помощью бромциана
2.10. 2. Использование глутарового альдегида
2.10.3. Применение карбодиимидов
2.10.4. Радиационно-химический метод активации целлюлозы
2.10.5. Синтез сополимера силохрома и поливинилового спирта
2.11. Иммобилизация ферментов на эпителии слизистой оболочки кишечника
2.12. Иммобилизация в альгинатных гелях
2.13. Статистическая обработка
Результаты и обсуждение Глава 3. Содержание и состав сериновых протеиназ в панкреатической ткани гидробионтов
3.1. Протеолитическая активность панкреатической ткани гидробионтов
3.2. Состав изоформ трипсинов и химотрипсинов
3.3. Молекулярная масса трипсинов и химотрипсинов
3.4. Классификация панкреатических сериновых протеиназ гидробионтов ... 115 Глава 4. Выделение и очистка ферментных препаратов
4.1. Применение ультрафильтрационной технологии для получения комплексных препаратов панкреатических протеиназ
4.1.1. Очистка экстракта с использованием адсорбентов
4.1.2. Ультрафильтрация
4.1.3. Сравнительный анализ предлагаемых и известных ранее методов
4.2. Использование метода аффинной хроматографии для очистки и выделения трипсина и химотрипсина
4.2.1. Аффинные сорбенты для очистки трипсина и химотрипсина, содержащие природные высокомолекулярные ингибиторы
4.2.2. Аффинные сорбенты, содержащие в качестве лигандов аминокислоты и их производные
4.2.3. Аффинные сорбенты для выделения анионных форм трипсина и химотрипсина
4.2.3.1.Аффинные сорбенты, содержащие в качестве лигандов 1,6 гексаметилендиамин
4.2.3.2. Аффинные сорбенты, имеющие в качестве лиганда гетероауксин
4.2.3.3. Аффинные сорбенты, имеющие в качестве лиганда бензоил-s-
аминокапроновую кислоту-гексаметилендиамин
4.2.4.Концентрирование белковых фракций и удаление элюэнтов
Глава 5. Исследование субстратно-ингибиторной специфичности панкреатических сериновых протеиназ различного происхождения.
5.1. Гидролиз белков панкреатическими ферментными системами различного происхождения
5.1.1. Кинетика гидролиза белковых субстратов
5.1.2. Молекулярный состав гидролизатов
5.1.3. Состав свободных аминокислот в ферментативных гидролизатах
5.2. Гидролиз коллагена: вклад отдельных протеиназ и влияние различных факторов
5.3. Субстратная специфичность гидролиза низкомолекулярных субстратов
5.4. Ингибиторная специфичность панкреатических сериновых протеиназ
5.4.1.Взаимодействие с низкомолекулярными обратимыми ингибиторами
5.4.2. Взаимодействие с природными белковыми ингибиторами
5.4.3. Взаимодействие с необратимыми ингибиторами
5.4.4. Взаимодействие протеолитических ферментов с пептидными иммунорегулято
рами, очистка и выделение ингибиторов
5. 4. 4.1. Сравнительный анализ ингибиторных свойств иммуномодуляторов

трипсинподобных протеаз рыб имеют большое сходство с этими параметрами фермента быка. Посредством электрофореза установлена молекулярная масса трипсина двоякодышащей рыбы (24 кДа) (Reek & Neurath, 1972), карпа (25 кДа) (Cohen at el., 1981), лососевых (22,5 кДа) (Пивненко и др., 1986). Молекулярная масса трипсина сельди значительно отличается (17,5 кДа), но расчет здесь производился по результатам аминокислотного анализа и сумме обнаруженных аминокислотных остатков (Kalae, 1978).
Аминокислотный состав трипсина исследованных рыб очень близок к составу фермента быка. Обнаружены различия в содержании некоторых аминокислот -треонина, серина, валина и некоторых других для трипсиновых протеаз, выделенных из сельди и мойвы (Kalac, 1978). Трипсин гренландской трески подобно ферменту млекопитающих богат серином, глицином и кислыми аминокислотами и содержит мало метионина и основных аминокислот (Simpson & Haard, 1984). Аналогично трипсину человека и овцы, он имеет восемь остатков цистеина и, следовательно, может образовывать всего четыре дисульфидных мостика, в то время как трипсин быка - шесть. Этим можно объяснить меньшую стабильность трипсина рыб. Кроме того, общий состав и концевая аминокислотная последовательность трипсина имеет очень высокую степень сходства с ферментами млекопитающих
Рик и Нейрат (1972) исследовали аминокислотный состав трипсиногена и пептида, образующегося при его активации в трипсин, у двоякодышащих рыб. Аминокислотный состав профермента был аналогичен составу трипсиногена быка и акулы, однако последовательность аминокислотных остатков активирующего пептида оказалась необычной. Для позвоночных большинства видов характерной особенностью активирующего пептида является тетрааспартильная последовательность, у двоякодышащих рыб этот пептид имеет только три аминокислотных остатка (глу-глу-аеп). Авторы полагают, что это результат эволюционной дивергенции двоякодышащих рыб от линии развития ведущей от класса беспозвоночных Plakodermi до примитивных амфибий, которые гипотетически имели в активирующем пептиде тетрааспартильную последовательность.
Аминокислотный состав трипсина тихоокеанских лососей существенно не отличался от состава аналогичных ферментов выделенных из панкреатической ткани животных других видов. Как и для других анионных изоформ трипсина, у данного