Нуклеотид-гидролизующая активность иммуноглобулинов и лактоферрина молока человека

• Автор: Семенов, Дмитрий Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 115 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Моноклональные абзимы
1.2. Природные абзимы
1.2.1. Природные абзимы с протеазной активностью
1.2.2. Природные абзимы, гидролизующие нуклеиновые кислоты
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Реактивы и материалы
2.2. Методы
2.2.1. Очистка нуклеотидов
2.2.2. Определение концентрации нуклеотидов
2.2.3. Тестирование нуклеотид-гидролизующей активности белковых препаратов
2.2.4. Определение кинетических параметров реакции гидролиза нуклеотидов, катализируемых антителами и лактоферрином
2.2.5. Анализ гомогенности белковых препаратов электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата Na
2.2.6. Выделение slgA и IgG из человеческого молока
2.2.7. Разделение slgA и IgG ионообменной хроматографией
2.2.8. Анализ препаратов белков встречной радиальной иммунодиффузией
2.2.9. Очистка Ig аффинной хроматографией на сорбентах с иммобилизованными антителами против иммуноглобулинов человека
2.2.10. Очистка и тестирование ферментативной чистоты АТР-абзимов гель-фильтрацией в условиях разрушения иммунных комплексов
2.2.11. Анализ сродства иммуноглобулинов к АТР с помощью аффинной хроматографии на АТР-сефарозе
2.2.12. Анализ сродства АТР-абзимов к ДНК аффинной хроматографией на ДНК-целлюлозе
2.2.13. Получение протеолитических фрагментов IgG

2.2.14. Определение концентрации белка
2.2.15. Модификация IgG и slgA аналогами АТР
2.2.16. Тестирование АТР-гидролизующей активности белков после их 42 разделения электрофорезом в полиакриламидном геле
2.2.17. Иммуноферментный анализ взаимодействия антител с белками
Escherichia coli
2.2.18. Выделение лактоферрина из человеческого молока
2.2.19. Гель-фильтрационный анализ олигомерных форм лактоферрина
2.2.20. Аффинная модификация лактоферрина химически активными 43 аналогами АТР
2.2.21. Ограниченный протеолиз лактоферрина трипсином
2.2.22. Ограниченный протеолиз лактоферрина бромцианом
2.2.23. Флуоресцентные измерения
2.2.24. Нумерация аминокислотных остатков в составе полипептида
лактоферрина
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Нуклеотид-гидролизующая активность иммуноглобулинов молока человека
3.1.1. Выделение иммуноглобулинов из молока
3.1.2. Тестирование АТР-гидролизующей активности препаратов
иммуноглобулинов после электрофореза в полиакриламидном геле
3.1.3. Совыделение фосфатазы молока с иммуноглобулинами
3.1.4. Анализ иммуноглобулинов аффинной хроматографией
3.1.5. Оптимизация условий протекания реакции гидролиза АТР, катализируемой slgA- и IgG-абзимами
3.2. Локализация ATP-гидролизующего центра абзимов
3.2.1. Аффинная модификация иммуноглобулинов химически активными аналогами АТР
3.2.2. Анализ АТР-азной активности Fab- и Fc- фрагментов иммуноглобулинов
3.2.3. АТРазная активность L и Н субъединиц иммуноглобулинов
3.3. Субстратная специфичность ATP-гидролизующих абзимов

3.3.1. Субстратная специфичность абзимов молока в реакции гидролиза
нуклеотидов
3.3.2. Взаимодействие NTP-гидролизующих абзимов молока с
нуклеиновыми кислотами
3.3.3. Взаимодействие NTP-гидролизующих абзимов с белками
3.4. Поиск ATP-гидролизующих ферментов молока человека
3.4.1. Выделение лактоферрина из молока
3.4.2. Взаимодействие лактоферрина с АТР
3.4.3. Локализация участка связывания АТР на молекуле лактоферрина
3.4.4. Конформационные перестройки лактоферрина
3.4.5.Влияние АТР на связывание лактоферрином казеина и гепарина
3.4.6. Гидролиз нуклеозидтрифосфатов лактоферрином молока
3.4.7. Локализация ATP-гидролизующего центра лактоферрина
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
5. ВЫВОДЫ
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

"вклиниваясь" между остатками дезоксирибозы, придает им
напряженную конформацию (рис. 11).
Интерпретация данных
рентгеноструктурного анализа в свете проявления BV04-01 -антителами
каталитической активности дала
возможность Д. Щурову [101, 104]
предположить, что расщепление ДНК происходит благодаря напряженной конформации сахарофосфатного остова
Рис. 11. Фрагмент активного центра антител в активном центре, а также благодаря BV04-01 в комплексе с б(рТ)з [101]. близости имидазольного кольца остатка
гистидина His L 27d к межнуклеотидной фосфатной группе. С помощью сайт-
направленного мутагенеза на генно-инженерном аналоге антител BV04-01 - SCA
было показано, что остатки His L 27d и Туг L 32 играют ключевую роль в катализе
гидролиза ДНК. Необходимо отметить, что рентгеноструктурные данные были получены
с использованием кристаллов комплекса антител с олигонуклеотидом в отсутствие ионов
двухвалентных металлов, которые необходимы для протекания реакции гидролиза ДНК.
Опираясь на данные, полученные компьютерным моделированием структуры комплекса
BV04-01 с (dT)i5 и ионами Mg2+, автором [101] было выявлено несколько факторов,
объясняющих механизм катализа гидролиза ДНК под действием абзима:
1) Стабилизация ДНК-субстрата в активном центре абзима в оптимальной для гидролиза конформации;
2) Координация ионом Mg2+ молекулы воды, которая может служить нуклеофилом в реакции гидролиза;
3) Стабилизация отрицательного заряда на кислороде уходящей группы.
В силу многообразия свойств НК-абзимов, выявленные с помощью анализа антител BV04-01, черты механизма гидролиза ДНК антителами могут быть в дальнейшем существенно дополнены. Остается также возможность принципиально иного объяснения нуклеазных свойств антител. В частности, нельзя отрицать возможности формирования на основе активного центра Ig функциональных элементов ДНКаз, РНКаз или фосфодиэстераз. Действительно, приведенные выше данные о
Ser Н 52а

Г *чД
Tpi V
JZ.Jy42

Asn Н 53 fArg Н
Trp HlOOa

His L 27d