Исследование механизма сопряжения синтеза АТФ и протонного транспорта АТФ-синтазой из пурпурной бактерии Rhodobacter capsulatus

• Автор: Фенюк, Борис Александрович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 142 с. : ил.

Содержание
1 Список сокращений
2 Введение
3 Обзор литературы
3.1 Разнообразие Н+-АТФаз
3.2 Структура фермента
3.3 Каталитический механизм работы Н+-АТФазы
3.4 Транслокация протонов и механизм сопряжения
4 Материалы и методы
4.1 Культивирование КЬ,ойоЪас1ег сарзиШт
4.2 Получение хроматофоров
4.3 Измерение концентрации бактериохлорофилла
4.4 Измерение АТФазной активности и синтеза АТФ
4.5 Получение КЬ. сарзиЫЫз
4.6 Оборудование для импульсной спектрофотометрии
4.7 Регистрация изменений А-ф
4.8 Определение концентрации Н+-АТФазы

4.9 Регистрация изменений внутреннего и наружнего
pH хроматофоров
4.10 Измерение концентрации реакционных центров
5 Результаты
5.1 Генерация и спад Атр
5.2 Перенос протонов через РоР1 в отсутствие нуклеотидов (слип)
5.3 Транспорт протонов через Ио
5.4 Транспорт протонов через РоИ1 в условиях синтеза АТФ
5.5 Эффект ингибиторов Их на протонный транспорт
5.6 Синтез АТФ и расчет отношения Н+/АТФ
5.7 Эластичная модель Н+-АТФазы
6 Обсуждение
7 Выводы

1 Список сокращений
АДн+ - трансмембранная разность электрохимических потенци-
алов ионов водорода
А ф - трансмембранная разность электрических потенциалов
дМФ - 1,1'-диметилферроцен
дцкд - А,А'-дициклогексилкарбодиимид
АТФ - аденозин-5'-трифосфат
АДФ - аденозин-5'-дифосфат
АМФ - аденозин-5'-монофосфат
БСА - бычий сывороточный альбумин
ДТТ - дитиотреитол
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
РЦ - реакционный центр
Трицин - N - трис (гид роксимети л) мети лг лицин
АМР-РАР - аденозин-5'-(Д,7-имидо)-трифосфат
НЕРЕЯ - А-З-гидроксиэтилпиперазин-А'Д-этансульфоновая
кислота
МОРЭ - 3-(А-морфолино)пропансульфоновая кислота
ТАРАТР - 2’,3’-0-(2,4,6-тринитрофенил)аденозин 5’-трифосфат
тт - 3-(трифторметил)-3-(лг-йодофенил)диазирин
КВБ-СІ - 4-хлоро-7-нитробензо-2-окса-1,3-диазол
дмсо - диметилсульфоксид

ставляет около 100 с 1 [104], для Н+-АТФазы митохондрий эта цифра выше: до 500 с“1 [93].
Исследования синтетической активности фермента E. coli, встроенного в липосомы, дали единственную АГт(АДФ)=27 мкМ; по фосфату Ä'm(Pj)=0.7 мМ [96].
Анализ АТФазной активности Fi E. coli в оптимальных условиях дает единственную Кт порядка 100 мкМ [118]. Однако, как будет показано ниже, несмотря на наличие единственной кажущейся 7vm(MgATP), в гидролизе в оптимальных условиях одновременно участвуют все три каталитических сайта, и потому он называется мулътисайтным гидролизом.
При субстехиометрических концентрациях АТФ фермент работает по принципиально иному механизму, называемому унисайтным гидролизом. Унисайтный гидролиз на несколько порядков медленнее мультисайтного. В этом случае в катализе одновременно участвует лишь один из каталитических сайтов. МАТФ связывается с одним из сайтов (Kd— 0.2 нМ для Fi E. coli: порядка 1 пМ для митохондриального Fi), и медленно гидролизуется до АДФ и Р*. Константа равновесия химической реакции гидролиза связанного с ферментом АТФ близка к единице, процесс легко обратим даже на Fi. Диссоциация продуктов гидролиза крайне медленна (константа скорости менее 10_3 с-1). Четыре стадии предполагаемого механизма унисайтного гидролиза составляют 1) связывание/диссоциация АТФ, 2) гидролиз/ресинтез