Характеристика нового ЦИС - элемента регуляции транскрипции генов млекопитающих вида (GCC)4

• Автор: Орлов, Сергей Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 97 с.

Оглавление
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Основные понятия об инициации траскрипции генов эукариот рнк-полимеразой П
2.2. САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ ФАКТОРЫ
2.3. ДНК-СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИЕ С GC-БОГАТЫМИ ЩС-ЭЛЕМЕНГАМИ
2.3.1. Белки семейства Spl
2.3.2. Белки семейства Egrl
2.3.3. Бетси семейства АР-
2.3.4. Белок CCGBP-
2.4. Структурно-функциональные свойства протяженных повторов (GCC)s
2.5. Промотор RPL
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Материалы исследования
3.2. Плазмиды
3.3. Генно-инженерное конструирование
3.4. Получение ядерных экстрактов
3.5. Гель-ретардация
3.6. Лигандныйблотшнг
3.7. Аффинная хроматография ядерных белков
3.8. Препаративная гель-ретардация
3.9. Генетическая трансформация клеток и анализ продуктов экспрессии генов-репортеров..
3.10. Выделение РНК и реакция обратной транскрипции
3.11. Полимеразная цепная реакция (PCR)
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. GCC-ЭЛЕМЕНГ ПРОМОТОРА RPL3 2 СПЕЦИФИЧЕСКИ ВЗАИМОДЕЙСТВУЕТ С ЯДЕРНЫМИ БЕЛКАМИ МЫШИ И ЧЕЛОВЕКА
4.2. Область промотора гена rpL32 (-24...+11) содержит композитный цис-элеменг, состоящийиз
GCC-ЭЛЕМЕНТА (-19... -4) И ПОЛИПИРИМИДИНОВОГО БЛОКА (-4...+11)
4.3. Взаимодействие фрагмента промотора гена rpL32 (-24...+11) с ядерными белками
ТКАНЕСШЦИФИЧНО
4.4. Взаимодействие фрагмента промотора rpL32 (-24. ..н-ll) с ядерными белками фибробластов
ЛЕГКОГО ЧЕЛОВЕКА И КЛЕТОК HEPG2 ЗАВИСИТ ОТ ИОНОВ ZN2+
4.5. В СОСТАВ ДНК-бежового комплекса, ОБРАЗУЕМОГО ФРАГМЕНТОМ ПРОМОТОРА RPL32 (-24.. +11),
ВХОДИТ НЕСКОЛЬКО БЕЛКОВ
4.6. GCC-ЭЛЕМЕНТ МОЖЕТ ДЕЙСТВОВАТЬ КАК ПОЗИТИВНЫЙ ИЛИ НЕГАТИВНЫЙ РЕГУЛЯТОР ТРАНСКРИПЦИИ В ЗАВИСИМОСТИ от ЕГО ЛОКАЛИЗАЦИИ ОТНОСИТЕЛЬНО ДРУГИХ РЕГУЛЯТОРНЫХ последовательностей
4.7. GCC-ФАКТОР ПРОЯВЛЯЕТ ПЕРЕКРЕСТНУЮ СПЕЦИФИЧНОСТЬ С ФАКТОРАМИ СЕМЕЙСТВА EGR НО НЕ С БЕЛКАМИ ГРУППЫ SP
4.8. ДНК-СВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛОК CCGBP-20 УГНЕТАЕТ АКТИВНОСТЬ ПРОМОТОРА ГЕНА RPL
ГЕН CCGBP-20 ЭКСПРЕССИРУЕТСЯ В КЛЕТКАХ HeLa и HepG2, но не активен в фибробластах легкого ЧЕЛОВЕКА
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
6. ВЫВОДЫ
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений
а. о. - аминокислотный остаток
Ац. Хф. - ацетилированные производные хлорамфеникола
кД - килодальтон
Хф. - хлорамфеникол
CAT - хлорамфениколацетилтрансфераза
CMV - цитомегаловирус человека
DEAE - диэтиламиноэтил
DTT - дитиотреитол
EDC - хлорогидрат 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) - карбодиимида
EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота
EGTA - (этилендиокси)диэтилендинитрилотетрауксусная кислота
HEPES - Х-2-гидроксиэтилпиперазия-Ъ!'-2-этансульфоновая кислота
HSV1 - вирус простого герпеса 1-го типа
MES - 2-морфолиноэтансульфокислота
ONPG - o-нитpoфeнил-ß-D-гaлaктoпиpaнoзид
PCR - полимеразная цепная реакция
PMSF - фенилметансульфонилфторид
rpL32 - рибосомный белок L
RT - обратная транскрипция
SDS - додецилсульфат натрия
Ж - тимидинкиназа

1. Введение
Актуальность проблемы Регуляция экспрессии генов эукариот в значительной мере осуществляется на стадии транскрипции, затрагивая отдельные гены, группы или множества генов, обусловливающих жизнедеятельность клеток на разных стадиях клеточного цикла, в процессах клеточной дифференецировки, морфогенеза и физиологической активности организма. Согласно современным представлениям, наиболее значимым уровнем регуляции транскрипции генов является инициация транскрипции.
Основными механизмами регуляции инициации транскрипции являются взаимодействия факторов белковой природы (транскрипционных факторов) со специфическими последовательностями ДНК (цис-элементами) в составе регуляторных районов генов (Mitchell P.J., 1989; Latchman D.S., 1991), изменение степени метилирования ДНК, в особенности промоторных областей (Bird A., 1992; Razin A., 1998), а также изменения структуры хроматина, связанные с модификациями гистонов (Steger D., 1998; Brownell J.E., 1996; Turner B.M., 1995). Детальный анализ модульной структуры регуляторных районов эукариотических генов является лидирующим направлением в изучении механизмов регуляции генной экспрессии. Работа в этом направлении, в значительной степени, сводится к выявлению цис-элементов, взаимодействующих с отдельными белками - факторами регуляции транскрипции, характеристике этих факторов, клонированию и изучению кодирующих эти факторы генов (Mitchell P.J., 1989). Описаны сотни факторов регуляции транскрипции (Вингендер Э., 1997), интенсивно ведутся поиски новых. Значительное внимание уделяется ДНК-белковым и белок-белковым взаимодействиям соответственно между цис-элементами в составе промоторов, энхансеров и транскрипционными факторами или между совместно связывающимися с ДНК факторами транскрипции (Carey М., 1998). Исследования в этой области привели к возникновению представлений об иерар-хичной организации цис-элементов в регуляторных районах генов эукариот. Близко расположенные сайты связывания транскрипционных факторов объединены в композитные цис-элементы, которые, в свою очередь, формируют энхансерные или промоторные области (Kel O.V., 1995). В связи с вышесказанным, весьма актуальным представляется поиск и описание новых цис-элементов эукариот, изучение транскрипционных факторов, взаимодействующих с ними, а также выяснение их возможного вклада в функционирование композитных цис-элементов в составе регуляторных областей генов, транскрибируемых РНК-полимеразой И.

• радиоактивные изотопы: дезоксинуклеозидтрифосфаты, меченые по а-положению или у-положению [32Р], - получены от В/О “Изотоп”, СПб; хлорамфеникол [14С] -получены от фирмы Amersham.
3.2. Плазмиды
В работе использовали ряд плазмид из коллекции лаборатории регуляции липидного обмена отдела биохимии НИИЭМ РАМН. Плазмида pPL32ASmaI содержит 5'-область гена rpL32. Плазмида pPCTl содержит бактериальный ген-репортер cat, кодирующий фермент хлорамфениколацетилтрансферазу под контролем промотора rpL32. Плазмида pTKcat содержит ген cat под контролем минимального промотора гена тимидинки-назы HSV1. Плазмида pCMVegrl содержит ген egrl под контролем промотора CMV. Плазмида pCMVlac содержит бактериальный ген-репортер lacZ, кодирующий фермент ß-галактозидазу, под контролем промотора CMV. Плазмиды pGGCtX и pGGC2X представляют собой, соответственно, одну и две копии GCC-элемента, встроенные в вектор pUC18. Плазмида pL32 содержит фрагмент промотора rpL32 (-24...+11), суб-клонированный в pUC18. Плазмида pTKGCCcat содержит GCC-элемент (GCC)3, встроеный в плазмиду pTKcat в 5’-положение относительно минимального промотора гена тимидинкиназы HSV1. Плазмида pCMVcgpl представляет собой эукариотический вектор экспрессии гена ccgbp-20 под контролем промотора CMV.
3.3. Генно-инженерное конструирование
Все генно-инженерные манипуляции проводили по стандартным протоколам
(Маниатис Т., 1984). Плазмиды pGGClX, pGGC2X и PTKGCCcat получены субклонированием олигонуклеотидных копий GCC-элемента, содержащих по концам линкеры HindlH, в вектора pUC18 и pTKcat соответственно по уникальному сайту рестрикции Hindlll. Плазмида pL32 получена субклонированием синтетической копии фрагмента rpL32 (-24...+11) в вектор pUC18 по уникальному сайту рестрикции Smal. Для получения вектора экспресии гена ccgbp-20 амплифицировали фрагмент 522 н. п., содержащий открытую рамку считывания гена ccgbp-20, методом PCR из вектора рТ7ТЗрас, содержащего кДНК гена ccgbp-20 (получен из I.M.A.G.E. Consorcium, клон 269133 через фирму Research Genetics). После промежуточного субклонирования в векторе pBluescript полученный фрагмент встраивали в вектор pCMV под контроль промотора CMV. Для амплификации использовали праймеры: 5' TCAGAATGGAGCGATTTG 3' и 5' GGTAACCTCCTAGTCAAC 3'