Фолдинг, сборка и стабильность фибритина бактериофага Т4

• Автор: Лондер, Юрий Яковлевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 127 с.

СОДЕРЖАНИЕ
Благодарности
Список сокращений
I. Введение
Актуальность проблемы
Цели и задачи работы
Научная новизна и практическая ценность работы
П. Литературный обзор. Суперспиральные coiled coil белки: структура,
фолдинг и функции
11.1. Структурные особенности coiled coil
II. 1.1. Основные принципы структуры coiled coil
11.1.2. Олигомерность coiled coil
II. 1.3. Ориентация цепей в coiled coil
II. 1.4. Роль заряженных остатков
II. 1.5. Пентамерный coiled coil
И. 1.6. Нарушения периодичности
II. 1.7. Правая суперспираль
11.2. Предсказание структуры coiled coil
11.3. Функции coiled coil
II. 3.1. Структурные белки
11.3 2. Ферменты и факторы транскрипции
11.3.3. Вирусные адгезины
П.3.4. Другие функции
П.4. Механизмы фолдинга и олигомеризации coiled coil
П.5. Фибритин бактериофага Т4
116. Заключение
III. Материалы и методы
III. 1 Бактериальные штаммы
111.2. Среды для выращивания бактерий
111.3. Плазмиды
111.4. Конструирование рекомбинантных плазмид
111.5. Полимеразная цепная реакция

III. 6. Приготовление компетентных клеток E. coli и трансформация
плазмидной ДНК
Ш.7. Экспрессия белков и анализ на растворимость
111.8. Анализ периплазматической фракции
111.9. Электрофорез белков
III. 10. Выделение и очистка белков
III. 11. Определение концентрации белка
III. 12. Ограниченный протеолиз
III. 13. Спектроскопия кругового дихроизма
III. 14. Изучение устойчивости фибритинов к нагреванию
III. 15. Изучение криорефолдинга
III. 16. Дифференциальная сканирующая калориметрия
III. 17. Гибридизация фибритинов in vitro
IV. Результаты исследований
IV. 1. Исследование устойчивости фибритина к додецилсульфату натрия
IV. 1.1. Устойчивость делеционных мутантов фибритина к ДСН
IV. 1.2 Криорефолдинг фибритинов в присутствии ДСН
IV. 1.3. Подтверждение роли С-концевого домена для устойчивости к ДСН
IV.2. Изучение устойчивости фибритинов к нагреванию
IV.3. Изучение роли петель в структуре фибритина
IV.3.1. Дизайн фибритина S1
IV.3.2. Экспрессия и свойства фибритина S1
IV.3.3.Очистка фибритина S1
IV.4. Получение новых мутантов для рентгеноструктурного анализа
IV. 5. Доказательство существования мономерного интермедиата
путем создания секретируемых фибритинов
IV.6. Инженерия пермутантного фибритина с фолдоном HaN-конце
IV.6.1. Дизайн фибритина Р
IV.6.2. Экспрессия и очистка фибритина Р
IV.6.3. Спектроскопия кругового дихроизма
IV.6.4. Ограниченный протеолиз
IV.6.5. Электрофоретические свойства фибритина Р
IV.6.6. Дифференциальная сканирующая калориметрия
IV.7. Гибридизация фибритинов in vitro

IV.7.1. Совместная ренатурация фибритинов В иР
IV.7.2. Совместная ренатурация фибритинов В иТМВ1
V. Обсуждение результатов
V.l. Устойчивость фибритина к додецилсульфату натрия
V.I.I. Криорефолдинг фибритинов
V.l.2. Роль С-концевого домена в обеспечении устойчивости к ДСН
V.I.3. Доменная организация фибритина
V.2. Роль петель в структуре фибритина
V.3. Получение новых мутантов для рентгеноструктурного анализа
V.4. Доказательство существования мономерного интермедиата
путем создания секретируемых фибритинов
V.5. Роль С-концевого домена в фолдинге и сборке фибритина
бактериофага Т4
V.5.I. Белки с полностью делетированным С-концевым доменом
неспособны к правильной сборке
V.5.2. Инженерия пермутантного фибритина с фолдоном на N-конце
V.5.3. Гибридизация фибритинов in vitro
VI. Выводы
VII. Литература

несколько необычной форме. Тримеризация обеспечивается главным образом за счет С-концевых спиралей каждого мономера, которые сначала закручиваются в правостороннюю спираль, а после излома, относящегося к Val92, связка становится левосторонней. Интересной структурной чертой является координация двухвалентного катиона (магния или марганца) тремя остатками Asp81. Дополнительная стабилизация тримера обеспечивается взаимодействиями с участием других (не С-концевых) спиралей [152]. Авторы отмечают сходство структуры мономера с синтетическим пептидом coil-Ser [105].
П.4. Механизмы фолдинга и олигомеризации coiled coil
К настоящему времени известно сравнительно мало работ, касающихся непосредственно процесса фолдинга структур coiled coil, причем большая часть выполнена на лей-циновом зиппере GCN4 или его производных. Ряд выводов сделан на основе данных по разворачиванию (денатурации) структур coiled coil in vitro. В ряде работ показано, что фолдинг in vitro зиппероподобных белков coiled coil протекает как бимолекулярная реакция в одну стадию (развернутый мономер о нативный димер), т.е. процессы олигомеризации и собственно фолдинга не разделены во времени [75, 82, 157, 181, 182, 196]. Скорость такой реакции лимитируется диффузией [182]. Однако в нескольких исследованиях, в частности Bosshard и соавторов, обсуждается двухстадийная кинетика фолдинга и олигомеризации производных лейцинового зиппера [180, 181]. Первая стадия - быстрая - является концентрационно-зависимой и, по-видимому, соответствует ассоциации полипеп-тидных цепей. Вторая стадия протекает медленно, причем скорость не зависит от концентрации. На этой стадии предположительно происходит конформационная реорганизация образовавшегося в быстрой реакции продимера. Интересно, что точечные замены в модельном пептиде изменяли кинетику реакций фолдинга и олигомеризации. Так, двойная замена Leul2Ala (позиция d) и Leu 16Ala (позиция а), также как и замена Leul6Asn, изме-