Участие анионных фосфолипидов цитоплазматической мембраны в секреции щелочной фосфатазы Escherichia coli

• Автор: Калинин, Андрей Евгеньевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 98 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ОРГАНИЗАЦИИ
СЕКРЕТОРНОГО ПРОЦЕССА У БАКТЕРИЙ
1.1. Секреторный аппарат E.coli
1.1.1. Цитоплазматические факторы секреции
1.1.2. Транслокационная АТФ-аза белок SecA
1.1.3. Мембранная часть транслокационного аппарата
1.1.4. Сигнальные пептидазы
1.1.5. Каталитический цикл транслоказы белков-предшественников
1.2. Особенности первичной структуры секретируемых белков
1.2.1. Сигнальные последовательности
1.2.2. Особенности структуры зрелой части
экспортируемых белков
ГЛАВА 2. УЧАСТИЕ ФОСФОЛИПИДОВ В СЕКРЕЦИИ БЕЛКА
2.1. Взаимосвязь секреции белка с составом и метаболизмом фосфолипидов
2.2. Участие анионных фосфолипидов в формировании сайта связывания и транслокации белка
2.3. Взаимодействие фосфолипидов с сигнальными последовательностями
2.4. Абсолютная необходимость анионных фосфолипидов для эффективной транслокации белка in vivo и in vitro
2.5. Участие анионных фосфолипидов в функционировании белковых компонентов секреторного аппарата
2.6. Необходимость непосредственного взаимодействия сигнальных последовательностей с анионными фосфолипидами
ЭКСПЕРИМЕНТ АЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Бактериальные штаммы, бактериофаги и плазмиды
3.2. Среды и условия культивирования
3.3. Ферменты и реактивы
3.4. Методы работы с ДНК
3.5. Олигонуклеотиднаправленный мутагенез
3.6. Субклеточное фракционирование
3.7. Определение скорости превращения предшественника щелочной фосфатазы в зрелую форму in vivo
3.8. Анализ состава и обмена фосфолипидов
3.9. Анализ интенсивности переноса глицерофосфата из фосфатидилглицерина на арбутин
3.10. Выделение предшественников природной и мутантных форм щелочной фосфатазы
3.11. Приготовление липосом
3.12. Взаимодействие предшественников природной и мутантных
форм щелочной фосфатазы с липосомами
3.13. Аналитические методы
3.14. Стереохимический анализ
ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ МУТАНТНЫХ ФОРМ ЩЕЛОЧНОЙ
ФОСФАТАЗЫ И ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ИХ СЕКРЕЦИИ
4.1. Введение направленных мутаций в ген щелочной фосфатазы
4.2. Изучение транслокации мутантных форм щелочной фосфатазы
через цитоплазматическую мембрану
4.2.1. Замены заряженных аминокислот в N-концевом домене
зрелой полипептидной цепи PhoA не влияют на эффективность ее транслокации через мембрану

4.2.2. Замены положительно заряженной аминокислоты
в N-концевом домене сигнального пептида prePhoA снижают эффективность секреции
4.2.3. Замены аминокислот вблизи места отщепления сигнального пептида приводят к полному ингибированию созревания prePhoA и его заякориванию в цитоплазматической мембране
ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ БЕЛОК-ЛИПИДНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В ПРОЦЕССЕ ТРАНСЛОКАЦИИ prePhoA ЧЕРЕЗ БАКТЕРИАЛЬНЫЕ МЕМБРАНЫ IN VIVO И IN VITRO
5.1. Секреция мутантных prePhoA с отщепляемым сигнальным пептидом не влияет на состав и обмен фосфолипидов
5.2. “Заякоривание” мутантных prePhoA в цитоплазматической мембране сопровождается накоплением анионных фосфолипидов
и усилением их обмена
5.3. Положительно заряженный аминокислотный остаток
в N-концевом домене сигнального пептида prePhoA участвует во взаимодействии с анионными фосфолипидами in vivo
5.4. Положительный заряд N-концевого домена сигнального пептида необходим для эффективного взаимодействия prePhoA
с модельными фосфолипидными мембранами in vitro
5.5. Наличие положительно заряженного аминокислотного остатка в N-концевом домене сигнального пептида повышает стабильность предполагаемого комплекса “СП - анионный фосфолипид”
ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНОЕ ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА

фосфолипидами мембраны, ингибируют фосфатидилглицерин-зависимую транслокацию OmpF-Lpp, но не влияют на фосфатидилглицерин-независимую (в случае 9-ти остатков Leu в гидрофобном коре СП) (Phoenix et at., 1993b).
Доказательства непосредственного взаимодействия сигнального пептида с фосфолипидами были получены с помощью фотоактивируемой сшивки. Если зрелая часть белка-предшественника транслоцируется через белковую пору, которая защищает полипептидную цепь от контакта с фосфолипидами (Joly, Wickner, 1993), то сигнальная последовательность в значительной мере окружена фосфолипидами (Martoglio et at., 1995; Mothes et at., 1997). Правда, авторы в двух последних случаях не определили, с каким именно фосфолипидом взаимодействовал сигнальный пептид, и показали только гидрофобную природу этого взаимодействия. Кроме того, результаты были получены на примере транслокации эукариотического белка в микросомы эндоплазматического ретикулума.
Таким образом, несмотря на достигнутые успехи, еще далехо до полного понимания на молекулярном уровне роли анионных фосфолипидов в процессе транслокации белка через цитоплазматическую мембрану бактерий.