Трансформация 2,4,6-тринитротолуола молочнокислыми бактериями

• Автор: Суворова, Елена Степановна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 94 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
1. Введение
2. Обзор литературы
2.1. Восстановление арильных нитрогрупп
2.2. Основные пути микробного метаболизма ТНТ
2.2.1. Трансформация ТНТ в аэробных условиях
2.2.2. Трансформация ТНТ в анаэробных условиях
2.3. Нитроредуктазы
2.3.1. Кислород-нечувствительные нитроредуктазы
2.3.2. Кислород-чувствительные нитроредуктазы
2.4. Молекулярные основы токсичности нитроароматических соединений
2.4.1. Цитотоксичность нитроароматических соединений
2.4.2. Генотоксичность нитроарилов
3. Материалы и Методы
3.1. Микроорганизмы и условия культивирования
3.2. Идентификацию молочнокислых бактерий
3.3. НП-ПЦР Фингерпринтинг геномов и выделение тотальной ДНК лактобацилл
3.4. Проверка чувствительности штаммов к ТНТ
3.5. Эксперименты по трансформации ТНТ
3.5.1. Трансформация ТНТ клеточными суспензиями
3.5.2. Трансформация ТНТ суспензиями протопластов
3.5.3. Трансформация ТНТ клеточными экстрактами
3.6. Тест на восстановление мембранонепроницаемых
акцепторов электронов
3.7. Определение ферментативных активностей
3.8. Очистка нитроредуктаз Ь./егтепШт В83601
3.8.1. Нитроредуктаза

3.8.2. Нитроредуктаза
3.9. Определение кинетических параметров нитроредуктаз
3.10. Определение молекулярного веса нитроредуктаз
3.11. Определение типа флавиновых кофакторов
3.12. Аналитические методы
3.12.1. НРЬС-анализ
3.12.2. ТЬС-анализ
3.12.3. Масс-спектрометрический анализ
3.12.4.'Н-ЯМР-анализ
3.12.5. Химический синтез стандартов: 2-АДНТ, 4-АДНТ и ГАДНТ
3.13. Определение концентрации белка
3.14. 808-РАА0 электрофорез
4. Обоснование выбора объекта исследования
5. Результаты
5.1.Выделение и идентификация лактобацилл, способных трансформировать ТНТ
5.1.1. Идентификация изолятов с использованием классических физиологобиохимических тестов
5.1.2. Использование фингерпринтинга геномов для дифференциации изолятов лактобацилл
5.2. Метаболизм ТНТ, ксенобиотика из класса полинитроароматических соединений
5.2.1. Активность трансформации ТНТ и ингибирование роста лактобацилл, осуществляющих гомо- и гетероферментативное брожение
5.2.2. Идентификация основных продуктов трансформации ТНТ лактобациллами
5.2.3. Активность оксидоредуктаз молочнокислого брожения исследуемых штаммов лактобацилл
5.2.4. Нитроредуктазная активность клеточных экстрактов лактобацилл
5.2.5. Ингибирование активности ключевых дегидрогеназ лактобацилл
под действием ТНТ и ГАДНТ
5.2.6. Локализация нитроредуктазной активности в клетках
Ь. /егтепШт В БЗ 601 и Ь.рІаШагит В
5.3. Очистка и характеристика нитроредуктаз штамма Ь/егтепШт В83601
5.3.1. Выделение и очистка нитроредуктазы (НР1) из мембранной фракции
5.3.2. Очистка внутриклеточной нитроредуктазы (НР2) штамма
Ь./егтепШтВ$360
5.3.3. Анализ кофакторной специфичности НР1 и НР2
5.3.4. Влияние температуры на активность и стабильность НР1 и НР2
5.3.5. рН-зависимость активности НР1 и НР2
5.3.6. Кинетические параметры НР1 и НР2
5.3.7. Молекулярный вес и субъединичный состав НР1 и НР2
5.3.8. Ингибиторы ферментативной активности нитроредуктаз
штамма Ь. /егтепШт ВБЗбО
5.3.9. Определение спектра утилизуемых нитроароматических субстратов НР1 и НР2
5.3.10. Интермедиаты и продукты реакций нитровосстановления, катализируемых нитроредуктазами НР1 и НР2
6. Обсуждение результатов
7. Заключение
8. Выводы
9. Литература

3. Материалы и методы
3.1. Микроорганизмы и условия культивирования. В работе использовали молочнокислые бактерии (МКБ), выделенные из молочнокислых (BS3601, BS3605, BS3606, BS3607), мясных продуктов (BS3608), ризосферы пшеницы (BS3604) и силоса (BS3602, BS3603). При идентификации методом фингерприн-тинга в качестве реперных использовали штаммы из коллекции ВКМ (ИБФМ, Россия). Штаммы лактобацилл культивировали на среде Рогозы (Rogosa et al, 1951) при 37°С в стационарных условиях (в пробирках с высоким слоем среды).
3.2. Идентификацию молочнокислых бактерий проводили на основе физиоло-го-биохимических тестов (Kandier, Weiss, 1986). Тесты на каталазную и оксидаз-ную активности, восстановление нитратов, образование аммиака из аргинина, сбраживание сахаров, газообразование, наличие элементов дыхательной цепи, рост при различных температурах и другие признаки определяли с применением стандартных методов (Методы бактериологии, 1984).
3.3. НП-ПЦР Фингерпринтинг геномов и выделение тотальной ДНК лактобацилл проводили в соответствии с (Welsh, McClealand, 1990). Реакционная смесь для ПЦР содержала: MgCl2 3 мМ, четыре дезоксирибонуклеодидтрифос-фата - по 0.2 мМ, праймер (univer direct pUC/M13 primer) - 10 мкМ, ДНК изоля-тов в качестве матрицы - 20 нг, taq-полимераза - 0.25 Ед в 25 мкл 1 х буфера (Stratagene). На реакционную смесь наслаивали 30 мкл минерального масла (Sigma). Реакцию амплификации выполняли по следующей схеме: 1 цикл - 95°С, 3 мин (денатурация); 5 циклов - 95°С, 1.5 мин (денатурация); 1 цикл - 40°С, 3 мин (отжиг); 1 цикл - 72°С, 3 мин (полимеризация); 30 циклов: 95°С, 1.5 мин (денатурация), 40°С, 1.5 мин (отжиг), 72°С, 1.5 мин (полимеризация) Результаты реакции анализировали с помощью электрофореза в 6% полиакриламидном геле.
3.4. Проверка чувствительности штаммов к ТНТ. Среду Рогозы с различными