Структура и функция гена РАХ-7 человека в норме и патологии

• Автор: Воробьев, Евгений Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 98 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Список сокращений
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Открытие РАХ генов
1.2. Структурная организация белков РАХ семейства
1.3. Структура ДНК - связывающих доменов PD и HD
1.3.1. Структура домена HD
1.3.2. Структура домена PD
1.4. Экспрессия РАХ генов в эмбриогенезе
1.5. РАХ гены и раковые заболевания человека
1.6. Гены РАХЗ и РАХ7
1.6.1. Экспрессия генов РАХЗ и РАХ7 в эмбриональном развитии
1.6.2. Патологии, связанные с потерей функции гена РАХЗ
1.6.2.1. Мутация Splotch мыши
1.6.2.2. Синдром Ваарденбурга
1.7. Альвеолярная рабдомиосаркома
1.7.1. Транслокация [t(2;13)(q35; q 14)] в альвеолярной рабдомиосаркоме
1.7.2. Транслокация [t(1;13)(p36.2; q14)] в альвеолярной рабдомиосаркоме
2. Материалы и методы исследований
2.1. Клеточные линии
2.2. Клонирование кДНК гена РАХ7
2.3. Клонирование кДНК химерного гена PAX7-FKHR
2.4. Клонирование и анализ геномных клонов гена РАХ7

2.5. Конструирование экспрессионных векторов
2.6. Культивирование клеток и получение клеточных линий.
2.7. Анализ ДНК-связывающей активности белков
2.8. Метод мягкого агара
2.9. Анализ клеточного цикла
2.10. Эксперименты с бестимусными мышами.
2.11. Анализ экспрессии известных генов методом обратной гибридизации.
2.12. Дифференциальный дисплей
2.13. Компьютерный анализ
3. Результаты исследований и их обсуждение
3.1. Клонирование и анализ кДНК гена РАХ7
3.1.1. Скрининг фаговой библиотеки кДНК
3.1.2. Рабдомиосаркома как источник РНК для клонирования
кДНК гена РАХ7
3.1.3. Клонирование кДНК гена РАХ7 методом RACE.
3.1.4. Старт трансляции белка РАХ7
3.1.5. Альтернативная терминация транскрипции гена РАХ7.
3.1.6. Альтернативный сплайсинг транскриптов гена РАХ7.
3.1.7. Белок РАХ7 отличается от РАХЗ уникальной последовательностью
в С - конце
3.2. Клонирование кДНК гибридного гена PAX7-FKHR.
3.3. Геномная организация гена РАХ7 человека.
3.3.1. Клонирование и анализ геномных клонов гена РАХ7.
3.3.2. Гены РАХ7 и РАХЗ имеют сходную геномную организацию.
3.3.3. Седьмой интрон гена РАХ7 вовлечен в транслокацию t(1; 13).
3.4. Клонирование геномных фрагментов генов РАХЗ и FKHR.

3.5. PAX7 - вероятный кандидат на роль гена опухолевого супрессора.
3.6. РАХ7 и синдром Ваарденбурга
3.7. Перенос генов РАХ7 и PAX7-FKHR в клетки NIH3T3 и получение стабильных клеточных линий с конститутивной экспрессией соответствующих белков
3.7.1. Эктопическая экспрессия как подход для функционального анализа генов РАХ7 и PAX7-FKHR
3.7.2. Эмбриональные фибробласты мыши в качестве тестовых клеток.
3.7.3. Получение клеточных линий, экспрессирующих белки РАХ7
и PAX7-FKHR
3.8. Функциональный анализ генов РАХ7 и PAX7-FKHR.
3.8.1. Общие характеристики полученных клеточных линий
3.8.2. Анализ клеточного цикла
3.8.3. Анализ клеток методом мягкого агара
3.8.4. Клетки, экспрессирующие PAX7-FKHR, образуют опухоли in vivo.
3.8.5. Обобщение результатов функционального анализа генов РАХ7
и PAX7-FKHR
3.9. Анализ дифференциальной экспрессии генов.
3.9.1. Анализ экспрессии известных генов методом обратной гибридизации.
3.9.2. Идентификация и клонирование генов методом "дифференциального дисплея"
Выводы
Список литературы.

2.2. Клонирование кДНК гена РАХ7
Неизвестные 5'- и 3'- концевые участки кДНК гена РАХ7 человека клонировали методом RACE (rapid amplification of cDNA ends), используя адапторные праймеры из наборов 5'-AmpliFINDER (Clontech) и З'-RACE (GIBCO BRL), согласно прилагаемым протоколам. Для амплификации кДНК РАХ7 использовали следующие ген-специфические праймеры:
Р1, 5' - GCTСССТТСАССССТGCTGCGA - 3’;
Р2, 5' - GTCGGCAAAAAATCGCTTCCCGT - 3’;
РЗ, 5' - CAGCACCACCGGCTACAGCG - 3’;
Р4, 5' - GCTATCAGTACGGCCAGTACGGCCA - 3';
Р5, 5' - GAAAGCTGGTGTGGAGGGAGA - 3';
Р6, 5' - GCAGAGGCTTAGCCAGGAGAT - 3'.
Полученные PCR продукты клонировали в Т-вектор (Clontech) и секвенировали.
2.3. Клонирование кДНК химерного гена PAX7-FKHR
кДНК химерного гена PAX7-FKHR клонировали с помощью метода RT-PCR, используя праймеры Р7, соответствующий последовательности определенного нами 5’ - конца кДНК РАХ7, и Р8, комплементарный 3’ - концу кДНК гена FKHR (Shapiro et al., 1993):
Р7, 5’ - GCTCTAGAGAAAGCTGGTGTGGAGGGAGA - 3’;
Р8, 5’ -CCGCTCGAGAAGTGTAACCTGCTCACTAACC - 3’.
Искусственные рестрикционные сайты Xbal и Xhol (подчеркнуты) были внесены в последовательности этих праймеров для более удобного клонирования соответствующего PCR продукта.