Роль гликозилирования белков в их секреции у дрожжей

• Автор: Туйметова, Галина Петровна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 89 с. : ил.

Список сокращений
БСА - бычий сывороточный альбумин
ГП- гликопротеин
ГР - гормон роста человека
2ДГ - 2-дезокси-О-глюкоза
кДа - килодальтон
КФ - кислая фосфатаза
ПААГ - полиакриламидный гель
п. н. - пара нуклеотидов
ТМ - туникамицин
Трис - трис(гидроксиметил)аминометан ТХУ - трихлоруксусная кислота ЭПР - эндоплазматический ретикулум ЭДТА - этилендиаминтетраацетат АТР - аденозинтрифосфат Asn - аспарагин Dol - долихол
Dol-P - долихилмонофосфат Dol-P-Man - долихилфосфат-Е)-манноза Dol-P-Glc - до; і и х и л ф ос ф ат- D- глюко за GTP - гуанозинтрифосфат Glc- глюкоза
GlcNAc - N-ацетилглюкозамин GDP-Glc - гуанозин-5-дифосфат-глюкоза GDP-Man - гуанозин-5-дифосфат-манноза GPI - гликозилфосфатидилинозитол Hsp - белки теплового шока Man - манноза
PMSF - фенилметилсульфонилфторид
SDS - додецилсуяьфат натрия
sec - секреторные мутанты
Ser - серии
Thr - треонин
ts - температуро-чувствительность
Содержание
Введение Обзор литературы
Глава 1. Основные типы гликозилирования белков у дрожжей
1.1 Биосинтез дрожжевых N-гликозидсвязанных олигосахаридов
1.2. Биосинтез дрожжевых О- гликозидсвязанных олигосахаридов
1.3. Биосинтез дрожжевого гликозилфосфатидилинозитольного якоря
1.4. Взаимосвязь гликозилирования и секреции белков у дрожжей Экспериментальная часть
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Культуры микроорганизмов и условия их выращивания
2.2. Тепловой шок
2.3. Изучение действия ингибиторов гликозилирования
2.4. Получение сферопластов из дрожжевых клеток
2.5. Лизис дрожжевых клеток
2.6. Получение субклеточных фракций
2.7. Электрофорез белков
2.8. Получение поликлональных антител
2.9. Иммуноэлектроблотгинг белков
2.10. Иммуноферментное определение гормона роста
2.11. Конструирование дрожжевых секреторных векторов
2.12. Другие методы
Глава 3. Результаты и обсуждение.
3.1. Роль N-гликозилирования в секреции гетерологичного белка - гормона роста человека у дрожжей Saccharomyces cerevisiae
3.1.1. Влияние ингибитора гликозилирования 2-дезокси-Д-глюкозы на секрецию гормона роста человека клетками трансформанта 20В-12/аК
3.1.2. Влияние ингибитора гликозилирования туникамицина на секрецию гормона роста человека клетками трансформанта 20В-12/аК
3.1.3. Влияние ингибитора гликозилирования туникамицина на секрецию гормона роста человека клетками трансформантов
20В-12/pGT 14-51 и 20B-12/pGT
3.2. Изучение роли О-гликозилирования белков в их секреции
3.2.1. Влияние ингибиторов гликозилирования на секрецию белков ГП400 и ГП280 клетками дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Hansenula polymorpha
3.2.2. Экспорт белка ГП400 дрожжевыми секреторными мутантами Saccharomyces cerevisiae sec53 и sec7
Заключение
Выводы
Цитированная литература

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Глава 2. Материалы и методы
2.1. Культуры микроорганизмов и условия их выращивания
Объектом настоящего исследования служили аскомицетные дрожжи рода Saccharomyces cerevisiae и Hansenula polymorpha. Перечень штаммов, их генотип и среды для их выращивания приведены ниже в таблице 1.
Таблица 1. Штаммы дрожжей, использованные в работе.
Штаммы Среда Особенности
Saccharomyces cerevisiae
Д32 (МАТа/МАТа) 1 дикий тип
20В-12 (МАТа, trpl, gal 2, рер 4-3) 1,2 ауксотроф по триптофану
20В-12/аК (МАТа, gal 2, рер 4-3) 2 несет плазмиду УЕрМРгеТЪОН
20B-12/pGT 29-7 (МАТа, gal 2, рер 4-3) 3 несет плазмиду УЕрРН()5
20B-12/pGT 14-51 (МАТа, gal 2, рер 4-3) 3 несет плазмиду УЕрРН05
RSY126 (МАТа, 1еи2-3,112,рер4, игаЗ, sec53) 1 - мутант
RSY300 (МАТа, ШЗ-11, 1еи2-3, игаЗ-I, secT) 1 1$ - мутант
Hansenula polymorpha BKMY-2559T 1 дикий тип
Культуры дрожжей поддерживали на косяках с соответствующей агаризованной средой (2 % агар).
Состав сред, использованных в работе:
N1 (YPD): 2 % глюкоза; 2 % пептон; 1 % дрожжевой экстракт.
N2: 2 % глюкоза; 0.17 % "Yeast nitrogen base w/o amino acid and ammonium sulfate” ("Difco", США); 0.5 % казаминокислоты ("Serva", Германия). При культивировании штамма S.cerevisiae 20В-12 в среду роста добавляли триптофан 40 мкг/мл.
N3: 0.9 % глюкоза; 0.17 % "Yeast nitrogen base w/o amino acid and ammonium sulfate" ("Difco", США); 1 % KC1; 0.5 % Mg2S04; 0.5 % (NHO2SO4; 0.5 % аспарагин. Эта среда была использована в двух вариантах: “низкий фосфат” (0.3 мМ или 0.004 % КН2Р04) и “ высокий фосфат” (7 мМ или 0.05 % КН2Р04).
Для получения инокулюма клетки пересевали с косяков в жидкую среду и выращивали в течение 14 часов. Клетки инокулюма вносили в колбы с соответствующей средой (оптическая плотность исходной культуры при этом ОДй6о=0.2-0.3). Культивирование