Получение мутантных форм фоторецепторного белка рековерина по его Ca2+-связывающим доменам методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза и исследование их функциональных свойств

• Автор: Алексеев, Андрей Михайлович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 103 с.

Оглавление
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Оптимизация экспрессии эукариотических полипептидов в E.coli
1.1. Конфигурация векторов для эффективной экспрессии гетерологических белков
1.2.Факторы, оказывающие влияние на уровне транскрипции при экспрессии рекомбинантных генов
1.2.1. Промоторы
1.2.2.Терминаторы транскрипции
1.2.3. Антитерминаторы транскрипции
1.2.4. Строго регулируемые системы экспрессии
1.3. Регуляция на уровне трансляции
1.3.1. Инициация трансляции мРНК
1.3.2. Энхансеры трансляции
1.3.3. Стабильность мРНК
1.3.4. Терминация трансляции
1.4. Пространственная локализация экспрессированного белка в E.coli
1.4.1. Цитоплазматическая экспрессия
1.4.2. Экспрессия в периплазму
1.5. Гибридные белки
1.6. Молекулярные шапероны
1.7. Синонимические замены аминокислотных остатков
1.8. Протеолиз белка в процессе экспрессии белка
1.9. Выбор питательных сред и условий ферментации
1.10. Заключение
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Материалы и реактивы
2.2. Ферменты
2.3. Методы
2.3.1. Выделение ДНК плазмид из бактериальных клеток
2.3.1.1. Выращивание ночной культуры E.coli
2.3.1.2. Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli
2.3.2. Выделение одноцепочечной формы фага М13шр19
2.3.3. Олигонуклеотид-направленный мутагенез рековерина
2.3.4. Мутагенез с помощью ПЦР, метод мегапраймера
2.3.5. Получение компетентных клеток E.coli
2.3.6. Трансформация клеток E.coli
2.3.6.1. Трансформация клеток E.coli штамма XL-1 вектором М13тр19, несущим мутантную кДНК рековерина
2.3.6.2. Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК

2.3.7. Определение нуклеотидной последовательности ДНК
2.3.8. Экспрессия рековерина и его мутантов в клетках Е.соИ
2.3.9. Выделение рекомбинантного рековерина дикого типа
2.3.10. Выделение мутантных форм рекомбинантного рековерина...61 ,
2.3.11. Аналитические процедуры
2.3.11.1. Определение концентрации белков
2.3.11.2. Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААТ)
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ЗЛ. Конструирование и экспрессия гена рековерина
3.1.1. Выделение и идентификация полноразмерного гена рековерина.

3.1.2. Клонирование и экспрессия гена рековерина
3.1.2.1. Клонирование гена рековерина
3.1.2.2. Экспрессия гена рековерина и характеристика полученного рекомбинантного препарата рековерина
3.1.3. Получение миристоилированного рекомбинантного рековерина.

3.1.3.1. Коэкспрессия генов рековерина и миристоилтрансферазы
3.1.3.2. Сравнение свойств природного и миристоилированного рекомбинантного рековерина
3.2. Клонирование, экспрессия и выделение мутантов рековерина, модифицированных по его Са2+-связывающим участкам
3.2.1. Сайт-направленный мутагенез рековерина по его Са2+-
связывающим участкам
3.2.1.1. Сайт-направленный мутагенез ЕБ2 и ЕБЗ
3.2.1.2. Сайт-направленный мутагенез одновременно по Е¥2 и ЕЕЗ
3.2.1.3. Сайт-направленный мутагенез ЕБ4
3.2.2. Экспрессия, выделение и очистка мутантов рековерина с
измененными Са2+- связывающими участками
3.3. Характеристика и функциональные свойства мутантов рековерина, модифицированных по его Са2+- связывающим участкам
3.3.1. Связывание Са2+ мутантными формами рековерина
3.3.2. Связывание мутантных форм рековерина с
фоторецепторными мембранами
3.3.3. Функциональная активность мутантов рековерина
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список принятых сокращений
кДНК комплементарная ДНК
ДСН додецилсульфат натрия
ИПТГ изопропил-Д-тиогалактозид
НСП наружный сегмент палочек
ПААГ полиакриламидный гель
ПЦР полимеразная цепная реакция
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭГТА этиленгликоль-бис/р-аминоэтиловый эфир
тетрауксусной кислоты [Ca2+]f свободная концентрация ионов Са2+
EF1, EF2, EF3 и EF4 соответственно, первый - четвертый Са2+-
связывающие участки рековерина -EF2, -EF3, -EF2,3 соответственно, мутантные формы рековерина
с “испорченными” участками EF2, EF3 и одновременно EF2 и EF3 +EF4 мутантная форма с “восстановленным”
участком EF4
nRc и mRc соответственно, рекомбинантный
немиристоилированный и миристоилированный рековерин Rh родопсин
RK родопсинкиназа
SspA фрагмент белка А из Staphylococcus aureus

1.5. Гибридные белки.
В последние годы значительный интерес возрос к созданию гибридных белков. Особенно это актуально для белков с малыми молекулярными массами. Такие гибриды защищают белки от протеаз, упрощают процедуру выделения белков.
Ухлен и др. [144] разработали систему экспрессии гибридных белков с использованием белка А из стафилоккоков. Кроме того, что белок А обладает аффиностью к IgG, этот белок действует как стабилизатор для улучшения фолдинга белка. Присутствие белка А служит причиной секреции в культуральную среду.
Альтернативным гибридным партнером является производное белка G из стрептоккоков, обладающее большой афинностью к альбумину. Минимальный домен связывания с альбумином содержит 46 аминокислотных остатков. Комбинация белка А и белка G в гибридных белках обеспечивает дополнительную стадию очистки, предохраняет гибридные белки от протеолитической деградации. Интересной особенностью белка G является способность продлевать период полураспада быстрораспадающих белков. Исследования показали, что период полураспада CD4 рецептора человека увеличивается в гибридных белках [160].
Присоединение тиоредоксина к белку резко увеличивает растворимость гибридных белков в цитоплазме E. coli и предотвращает образование телец включения [161]. Подобным образом гомолог тиоредоксина DsbA недавно был использован в качестве гибридного белка для прямого транспорта белков в периплазму [162].