Нуклеазные активности антител и лактоферрина молока человека

• Автор: Канышкова, Татьяна Геннадьевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 144 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ЗАЩИТНЫЕ ФАКТОРЫ МОЛОКА ЧЕЛОВЕКА
1.1. Клетки молока
1.2. Гормоны и факторы роста
1.3. Олигосахариды, липиды и жирные кислоты
1.4. Нуклеиновые кислоты
1.5. Основные защитные факторы молока белковой природы
1.5.1. а-Лактальбумин
1.5.2. Лизоцим
1.5.3. Интерф ероны
1.5.4. Комплемент
1.5.5. Лактоферрин и иммуноглобулины - мажорные защитные белки молока
1.6. Лактоферрин
1.6.1. Биологические функции лактоферрина
1.7. Антитела
1.7.1. Биологические функции антител молока
1.8. Каталитические антитела
1.8.1. Природные абзимы при аутоиммунных патологиях
1.8.2. Природные абзимы с протеазной активностью
1.8.3. Природные абзимы, катализирующие гидролиз нуклеиновых кислот
1.8.4. Исследования структуры активного центра ДНК-гидролизующих антител
1.8.5. Природные абзимы молока человека
1.8.6. Роль природных абзимов в организме
1.8.7. Возможные причины генерации природных абзимов
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ
2.2. МЕТОДЫ
2.2.1. Выделение иммуноглобулинов из человеческого молока
2.2.2. “Кислотный шок” препаратов антител

2.2.3. Получение фрагментов АТ
2.2.3.1. Получение и очистка Р(аЬ)2-фрагмента IgG
2.2.3.2. Получение и очистка Fab-фрагмента IgG
2.2.3.3. Получение и очистка Fab-фрагмента slgA
2.2.3.4. Разделение субъединиц антител на ДНК-целлюлозе
2.2.4. Выделение ЛФ из молока
2.2.5. Получение Fe'-ЛФ
2.2.6. Ограниченный протеолиз ЛФ трипсином
2.2.7. Ограниченный протеолиз ЛФ бромцианом
2.2.8. Анализ сродства АЗ’ и ЛФ к ДНК с помощью аффинной хроматографии белков 47 на ДНК-целлюлозе
2.2.9. Электрофоретический анализ белков
2.2.10. Электрофоретический анализ белков методом двумерного электрофореза в 48 ПААГ
2.2.11. Получение и очистка 5’-[32Р]-меченых олигонуклеотидов
2.2.12. Получение производных олигонуклеотидов
2.2.12.1. Получение 23’-диальдегидного производного олигонуклеотидов
2.2.12.2. Получение 4-диметиламинопиридиниевого производного олигонуклеотидов
2.2.13. Модификация АТ и ЛФ химически активными производными 50 олигонуклеотидов
2.2.13.1. Модификация белков 2’,3’-диальдегидным производным олигонуклеотидов
2.2.13.2. Модификация белков 4-диметиламинопиридиниевым производным 50 олигонуклеотидов
2.2.14. Методы определения нуклеазной активности антител и лактоферрина
2.2.14.1. Определение активности АТ и ЛФ в реакции гидролиза ДНК фага А. и ДНК 51 плазмид pBR-322, pBR-327 и pUC
2.2.14.2. Определение активности АТ и ЛФ в реакции гидролиза олигонуклеотидов
2.2.14.3. Гидролиз сСМР
2.2.14.4. Гидролиз in vitro транскриптов тРНК препаратами антител
2.2.15. Определение кинетических параметров реакции гидролиза
2.2.16. Тестирование ДНК- и РНК-гидролизующей активности белков in situ
2.2.17. Сиектрофлуориметрическое определение сродства ЛФ к ДНК
2.2.18. Определение сродства ON к ЛФ методом ретардации в ПААГ

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Выделение иммуноглобулинов из молока
3.1.1. Г ель-фильтрация АТ в условиях “кислотного шока”
3.1.2. Взаимодействие антител молока с ДНК-целлюлозой
3.2. Проверка эффективности схемы выделения НК-гидролизующих абзимов
3.3. Взаимодействие абзимов с аффинными сорбентами
3.4. Локализация НК-связывающего/НК-гидролизующего центра антител
3.4.1. Каталитическая активность Fab-фрагментов IgG и slgA
3.4.2. Аффинная модификация антител с помощью реакционноспособных аналогов 77 олигонуклеотидов
3.4.3. Каталитическая функция легкой цепи антител
3.4.4. Анализ ДНК- и РНК-гидролизующей активности антител in situ
3.4.5. Определение типа легких цепей ДНК- и РНК-гидролизующих абзимов молока
3.5. Субстратная специфичность реакции гидролиза ДНК и РНК с помощью абзимов
3.6. ДНК-гидролизующая активность абзимов
3.6.1. Зависимость ДНК-гидролизующей активности АТ от pH
3.6.2. Зависимость активности абзимов от ионов двухвалентных металлов
3.7. РНК-гидролизующая активность абзимов
3.8. Кинетические характеристики реакции гидролиза олигонуклеотидов с помощью 95 абзимов
3.9. Нуклеазы молока неиммуноглобулиновой природы
3.10. Выделение лактоферрина
3.10.1. Аффинная хроматография ЛФ на Blue Sepharose
3.11. Взаимодействие ЛФ с ДНК-целлюлозой
3.12. “Кислотный шок” ЛФ
3.13. Тестирование активности ЛФ in situ
3.14. ДНК-гидролизующая активность ЛФ
3.15. Локазизация ДНК-и РНК-связывающих центров ЛФ
3.16. Определение сродства ЛФ к олигонуклеотидам
3.17. Взаимодействие ON-связывающих центров ЛФ с некоторыми полианионами
3.18. Кинетические характеристики реакции гидролиза олигонуклеотидов с помощью 122 ЛФ
3.19. Активация ДНК-гидролизующей функции ЛФ под действием

активности РНКазы А; активность же абзимов в расщеплении поли(А) в 20 раз превосходит таковую для РНКазы А [96].
Следует особо отметить, что все более ранние исследования абзимов, возникающих в организме человека при аутоиммунных патологиях, проводили с иммуноглобулинами класса в - основными антителами крови человека. Авторы, исследовавшие РНК-гидролизующую активность аутоантител при СКВ, впервые исследовали 1дМ - иммуноглобулины, формирующие первичный иммунный ответ организма [96, 97]. Было показано, что и и при СКВ обладают РНК-гидролизующей активностью, однако, именно иммуноглобулины класса М оказались наиболее эффективными катализаторами реакции гидролиза РНК.
В работе [93] были исследованы ДНК- и РНК-гидролизующие активности антител из сыворотки больных рассеянным склерозом (РС). Аналогично СКВ-абзимам, РС-абзимы проявляли высокую степень вариабельности каталитической активности, так, например, их относительная РНКазная активность изменялась в очень широком диапазоне, от 1 до 100% по отношению к активности РНКазы А (при использовании суммарной РНК в качестве субстрата), а в некоторых случаях достигала даже 200-250%. В целом же, РС-абзимы ~ в 10-20 раз лучше, чем РНКаза А расщепляли поли(А), со сравнимой скоростью гидролизовали поли(и) и суммарную РНК и гораздо хуже (4-8% от активности РНКазы А) - поли(С) и сСМР.
В целом, анализ литературных данных, касающихся изучения абзимов-нуклеаз, показывает, что разделение суммарного пула природных поликлональных каталитических антител ни в одном из известных случаев не приводил к селективному выделению только ДНК- или только РНК-абзимов. Можно полагать, что такие абзимы, в принципе, могут гидролизовать оба типа субстратов - и ДНК и РНК. На это косвенно указывают данные работы [98], в которой описаны каталитические свойства моноклональных антител к В-ДНК из крови мышей: наряду со способностью связывать и гидролизовать ДНК, такие абзимы проявляли каталитическую активность и в отношении РНК, причем степень гидролиза РНК более чем на порядок превышала таковую в случае ДНК.
С другой стороны, суммарный пул поликлональных абзимов может содержать одновременно и ДНК-, и РНК-гидролизующие антитела, характеристические свойства которых (например, изоэлектрическая точка, сродство к нуклеиновым кислотам и проч.) могут отличаться столь незначительно, что эффективно отделить их друг от друга не представляется возможным. По всей видимости, реальная ситуация может быть в достаточной степени индивидуальной для определенного типа заболевания и даже,