Изучение нуклеотидных последовательностей и серологических свойств V 3 петли ВИЧ-I на материале из Санкт-Петербурга и Украины

• Автор: Набатов, Алексей Анатольевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 138 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Развитие эпидемии ВИЧ/СПИД в мире
2.2. Геном ВИЧ-1, свойстваи функции вирус-специфичных белков
2.3. Вариабельность ВИЧ
2.4. Структурам функции поверхностного гликопротеина
ОР120 ВИЧ
2.5. Гуморальный ответ на ВИЧ
2.6. Субтипы ВИЧ-1 и методы определения субтипов ВИЧ
2.6.1. ПЦР-секвенирование
2.6.2. Серотипирование
2.6.3. Гетеродуплексный анализ
2.7. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-инфекции
2.7.1. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-инфекции в мире
2.7.2. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-инфекции в странах бывшего СССР
3.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Пациенты
3.2.Метод пептидного ИФА
3.2.1. Синтетические пептиды

3.2.2.Твердофазныйиммуноферменгный анализ...;.и.1).».у
3.3. Получение материала из периферической крови ВИЧ-инфицированных пациентов
3.3.1 Получение сывороток
3.3.2 Получение плазм и МКГЖ
3.4. Методы очистки ДНК
3.4.1. Выделение ДНК из МКПК ВИЧ-инфицированных пациентов
3.4.2. Выделение плазмидной ДНК
3.4.3. Выделение фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы
3.4.4. Очистка ДНК мезвду ферментативными реакциями
3.5. Амплификация ВИЧ-специфичныхфрагментов
3.6. Анализ нуклеиновых кислот
3.6.1. Электрофорез препаратов ДНК
3.6.2. Препаративный электрофорез препаратов ДНК в легкоплавкой агарозе
3.6.3. Электрофорез препаратов ДНК в ПААГ в неденатурирующих условиях
3.6.4. Электрофорез препаратов ДНК в ПААГ в денатурирующих условиях
3.6.5. Перенос и иммобилизация препаратов ДНК на фильтрах
3.6.6. Методы молекулярной гибридизации
3.6.6.1. Меченые ДНК радиоактивными изотопами
3.6.6.2. Гибридизация нуклеиновых кислот на фильтрах
3.7. Клонирование амплифицированных ВИЧ-специфичных фрагментов
3.7.1. Подготовка плазмидного вектора для клонирования
3.7.2. Подготовка амплифицированного фрагмента для клонирования
3.7.2.1. Выделение и очистка фрагментов амплифицированной ДНК из легкоплавкой агарозы
3.7.2.2. Модификация концов амплифицированных фрагментов
3.7.2.3. Фосфорилировапие концов амплифицированных фрагментов
3.7.3. Лигирование
ЗЛА. Подготовка компетентных клеток Е.соИ для трансформации
3.7.5. Трансформация клеток Е.соИ рекомбинантными плазмидами
3.7.6. Отбор рекомбинантных клонов
3.7.7. Анализ клонированных фрагментов
3.7.7.1. Рестрикционный анализ рекомбинантных плазмид
3.7.7.2. Анализ рекомбинантных плазмид методом ПЦР
3.8. Секвенирование фрагментов ДНК
3.8.1 Секвенирование клонированных фрагментов ДНК

3.8,2. Прямое секвенирование амплифицировавных фрагментов ДНК
3.9. Математические методы анализа данных
3.9.1. Методы анализа многомерных данных при серотшшровании
3.9.2. Методы анализа нуклеотидных последовательностей
3.9.2.1 Поиск межсубтипных рекомбинаций в последовательностях ВИЧ
3.9.2.2 Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей
3.9.3. Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Нуклеотидные последовательности УЗ петли ВИЧ-1 на материале Санкт-Петербурга и Украины
4.1.1. Амплификация еял-специфичных фрагментов вариантов ВИЧ-1 из г. Санкт-Петербург и Украины
4.1.2. Результаты клонирования епр-специфичных фрагментов
4.1.3. Определение нуклеотидных последовательностей еят-специфичных фрагментов ВИЧ
4.1.3.1. Определение нуклеотидных последовательностей участков гена ет> вариантов ВИЧ-1 методом секвенирования клонированных фрагментов
4.1.3.2. Определение нуклеотидных последовательностей ВПЧ-специфичныхучастков гена ет> методом прямого секвенирования
4.1.4. Результаты поиска максимально гомологичных последовательностей в Банке генов
4.1.5. Результаты филогенетического анализа ну клеотидных последовательностей
4.2. Изучение антигенного разнообразия ВИЧ
4.2.1. Изучение гомологии реконструированных аминокислотных последовательностей ВИЧ и синтетических пептидов, взятых для анализа
4.2.2. Изучение спектров иммунореактивности сывороток, взятых на различных сроках ВИЧ-инфекции
4.2.3. Изучение спектров иммунореакгивности сывороток в популяции украинских ВИЧ-инфицированных
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
6.ВЫВОД Ы
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
8.ПРИЛОЖЕНИ Я

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ
АТФ Аденозин трифосфат
а/к Аминокислоты
БСА Бычий сывороточный альбумин
ВИО Вирус иммунодефицита обезьян
ВИЧ-1(2) Вирус иммунодефицита человека первого (второго) типа
ВОЗ Всемирная Организация Здравоохранения
ДЕАЕ Диэтиламиноэтил
ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота
дНТФ Дезоксинуклеотид трифосфат
ДТТ Дитиотреитол
мкпк Мононуклеарные клетки периферической крови
мРНК Информационная РНК
О.Е. Оптическая единица
OIIn Оптическая плотность при длине волны N
ПЦР Полимеразная цепная реакция
РНК Рибонуклеиновая кислота
спид Синдром приобретенного иммунодефицита
т.п.н. тысячи пар нуклеотидов
тРНК Транспортная РНК
ТАЕ 40мМ Трис-ацетат; 2мМ EDTA, pH 8
ТЕ 20мМ Трис-НС1 pH 8,0; 1мМ EDTA
Трис Трис(гидроксиметил)аминометан
УФ Ультрафиолет
СІР / . Щелочная фосфатаза теленка
DMSO ’ Диметилсульфоксид
EDTA ...J Этилендиаминотетраацетат динатриевая соль
НМА Метод гетеродуплексного анализа (heteroduplex mobility assay)
IPTG Изопропил-Р-тио-галактопиранозид
kD Килодальтон
LB Среда Luria-Bertani (1% бакто-триптон; 0,5% дрожжевого экстракта; l%NaCl)
LB-агар 1% бакто-триптон; 0,5% дрожжевого экстракта; 1% NaCl 1,5% бакто-агар
LTR Длинный концевой повтор (от англ. long terminal repeat)
PBS Натрий-фосфатный буфер (150мМ NaCl; 20мМ Na2HP04/NaH2P04, pH 7,6)
SDS Додецилсульфат натрия
ssc 0.15М NaCl; 0.015М Na-цитрат, pH 6
TBE 0,089М Трис-борат;89 мМ борная кислота; 2мМ EDTA, pH 8
WHO World Health Organization (то же, что ВОЗ)
X-gal 5-бромо-4-хлоро-3-индолил- P-D-галактопиранозид
X Длина волны

Таблица 1.
Распространенность различных субтипов ВИЧ-1 (по гену ет) в странах мира
Группа ВИЧ-1 Субтип Место максимальной представленности субтипа ВИЧ-1 Литературная ссылка
А Центральная Африка Bruce et al., 1993
В США, Западная Европа Louwagie et al., 1993
В' Таиланд Takebe et al„ 1994
С Эфиопия, Индия Sherefa et al., 1994; Delwartetal.,1993
D Центральная Африка Pestano etal., 1993;
М Е Таиланд Gao et al., 1996
F Бразилия Sabino et al., 1994
G Центральная Африка Kaleebu et al., 1995
Н Центральная Африка Myers et al., 1996
I Кипр Kostrikis et al., 1995
О Камерун Gürtler et al., 1993
Как видно из таблицы 1, набольшее субтипическое разнообразие приходится на страны Центральной Африки, что может свидетельствовать об африканском происхождении ВИЧ (Sharp, 1994). Субтип В наиболее представлен в странах Северной Америки и Европы. Субтипы В' и Е имеют максимальное распространение в Таиланде, причем в разных группах риска: наркоманов и лиц с.беспорядочными половыми связями, соответственно.
2.7.2. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-инфекции в странах бывшего СССР
Молекулярно-биологический анализ последовательностей ВИЧ-1 полученных на ранней стадии ВИЧ-инфекции в странах бывшего СССР (1987-1995 г.г.) показал достаточно широкую представленность различных субтипов ВИЧ-1. На территории стран бывшего СССР были обнаружены субтипы А, В, С, О, Е, в, Н и Р (Кагатоу е1 а1., 1996; ВоЬкоу е! а1., 1997 а,Ь,с; Селимова с соавт., 1998; Смольская с соавт., 1997). Кроме того, было обнаружено широкое и внутрисубтипическое разнообразное изолятов ВИЧ-1, обнаруживаемых в России (Козлов и соавт., 1997). Тем не менее не существовало какого-