Изучение механизма протонирования вторичного хинонного акцептора в реакционных центрах Rhodobacter sphaeroides

• Автор: Гопта, Оксана Александровна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 137 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Фотосинтетический циклический перенос электронов у пурпурных бактерий
1.2. Структура реакционных центров ЯЬ. $ркаего1йе&
1.2.1. Строение РЦ
1.2.2. Структура сайта связывания (д
1.2.3. Структура сайта связывания Ов
1.2.4. Связывание ингибиторов переноса электронов в сайте (}в РЦ
1.2.5. Молекулы воды в структуре РЦ
1.3. Электрохимические свойства хинонов
1.4. Перенос электронов и протонов в РЦ пурпурных бактерий
1.4.1. Цикл восстановления хинона
1.4.2. Двухтактные колебания концентрации семихинона Ов*
1.4.3. Взаимодействие семихинонов с экзогенными акцепторами
1.4.4. Рекомбинация зарядов с хинонных акцепторов на окисленный пигмент
1.4.5. Перенос первого электрона от Од'-на Ов
1.4.6. Перенос второго электрона от 0А* на Ов’~
1.4.7. Поглощение протонов РЦ в ответ на освещение
1.4.8. Корреляция между кинетиками переноса электронов и поглощения
протонов
1.4.9. Обмен 0 и ОНз с хинонами пула
1.5. Влияние направленного мутагенеза на кинетику переноса протонов и электронов
1.5.1. Мутации, влияющие на перенос протонов
1.5.2. Мутации, не влияющие на перенос протонов
1.6. Электрогенные реакции при функционировании РЦ
1.7. Проблематика изучения РЦ
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Выращивание несерных пурпурных бактерий ЯНойоЬасЬег sphaeroides и КНойоЬаиег сарзиЫЫв
2.2. Выделение хроматофоров
2.3. Спектрофотометрические измерения
2.4. Регистрация светоиндуцированной кинетики генерации трансмембранного потенциала в хроматофорах
2.5. Кинетический анализ сигналов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. рН-зависимость константы равновесия (Вдв) реакции
Оа* Ов ОаОв' в РЦ хроматофоров с убихиноном-50 и децил-убихиноном в качестве хинонного акцептора <3Б
3.1.1. Определение Цлв с помощью импульсной спектрофотометрии
3.1.2. Определение ЦдВ с помощью прямого электрометрического метода
3.1.3. Чем определяется характер рН-зависимости ЦдВ
3.2. Определение оптимальных концентраций ингибиторов для
электрогегшых фаз В1 и В2
3.3. Корреляция между кинетиками переноса второго электрона (к2дв),
электрогенного поглощения протонов (Д|/В2) и защелачивания среды в ответ па вторую вспышку света
3.3.1. Влияние рН-буфера на кинетику электрогенной фазы В2
3.3.2. Влияние рН-буфера на кинетику ответа рН-красителя
3.4. Возможный механизм обмена протонов между Ов-сайтом РЦ
хроматофоров ЯЬ. зркаего{с1е5 и внешней водной фазой
3.5. Зависимость кинетики электрогенной фазы В1, сопряженной с
переносом первого электрона (Од*~Ов < > ОдОв" ), от pH и температуры
3.5.1. Перенос первого электрона между хинонными акцепторами
3.5.2. Чем определяется перенос первого электрона?
3.5.3. Какое рКтемн у остатка 01и-Ь212 в РЦ?
3.6. Влияние температуры, pH и ионной силы на электрогенное поглощение
протонов при восстановлении (}в*' (СдОв’ <-» ОдОвНг)
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

5. ВЫВОДЫ
6. СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

зависимости Ьдв Для изолированных РЦ Rb. sphaeroides из работ [Maroti and Wraight, 1988; Okamura and Feher, 1992], хроматофоров Rb. sphaeroides [Следь, 1985], РЦ и хроматофоров Rb. capsulatus [Lavergne et al., 1999]. Важно отметить, что для хроматофоров характерен сдвиг pH-зависимости в сторону больших значений Lab и наличие четко выраженных перегибов в областях более щелочных pH, чем для выделенных РЦ. Похожий характер pH-зависимости LAb был получен в нашей работе (см, раздел 3.1.) для хроматофоров Rb. sphaeroides. По-видимому, в стабилизации Qg“- важную роль играет хроматофорная мембрана.
В литературе существует гипотеза о том, что характер pH-зависимости Ьдв определяется электростатическим взаимодействием между ближайшими заряженными формами аминокислотных остатков и семихинонами. Образование 0А‘ и Qb*~ индуцирует щелочной сдвиг рК этих остатков (рКтемн —> рКсвет), что сопровождается их протонированием, в основном это Asp-L213 (рКхемн ~ 4-4.5, рКсвет ~ 6) и Glu-L212 (рКтемн ~ 9-5 ,рКсвет > 12) [см. обзоры Shinkarev and Wraight, 1993 и Okamura and Feher, 1995]. При pH < 6 протонируется остаток Asp-L213, при pH > 6 - остаток Glu-L212, что приводит к зависимости Ьдв от pH. В выделенных РЦ наблюдается сдвиг рК этих двух остатков на 1-1.5 ед. в сторону кислых pH.
1.4.3. Перенос первого электрона от Q&~ на Qg.
Константа скорости переноса первого электрона между хинонами в изолированных РЦ Rb. sphaeroides кАв1 й Ю4 с'1 [см. табл. 4 и Vermeglio, 1977; Wraight, 1979; Kleinfeld et ah, 1984]. Эта реакция представлет значительный интерес, так как на уровне хинонных акцепторов происходит стабилизация электрона на секундной временной шкале. Кинетика переноса первого электрона была измерена непосредственно
а) по изменению поглощения Q*“ на длине волны 450 нм [Vermeglio, 1977; Wraight, 1979],
а также с помощью косвенных методов по оценке скоростей реакций, сопровождающих перенос первого электрона;
б) по изменению сдвига полос поглощения БФео на 760 нм (этот сдвиг интерпретируют как результат электрохромного взаимодействия между восстановленным хиноном и БФео) с помощью последовательных двойных вспышек света с варьированием времени между ними [Tiede et al., 1996],
в) по зависимости кинетики темнового восстановления Р870 от температуры