Характеристика взаимодействия моноклональных антител с различными олигомерными формами D-глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы

• Автор: Григорьева, Юлия Александровна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 133 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Моноклональные антитела и их взаимодействие с антигенами
Взаимодействие антитела с антигенной детерминантой
Организация эпитопа
Использование моноклональных антител для изучения
олигомеризации и сворачивания белков
Методы характеристики антигенной детерминанты
Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа: структура и функции
Основные свойства и роль в катализе
Олигомерные состояния ГАФД и ее функции в клетке
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы
Определение концентраций реагентов
Определение концентрации белков в растворе
Определение концентрации иммобилизованных белков
Определение активности ГАФД
Выделение ГАФД
ГАФД из мышц кролика
ГАФД из В. stearothermophilus
Получение апо-ГАФД
Гель-фильтрация на Суперозе
Твердофазный иммуноферментный анализ ELISA

Взаимодействие антител с сорбированным антигеном
Взаимодействие антител с антигеном в растворе
Очистка антител
Иммобилизация белков на сефарозе
Активация сефарозы
Иммобилизация ГАФД
Иммобилизация антител
Получение иммобилизованных за одну субъединицу димеров
ГАФД
Получение иммобилизованных за одну субъединицу мономеров
ГАФД
Получение иммобилизованных за две субъединицы димеров
ГАФД
Процедуры инкубации иммобилизованных белков с
растворимыми партнерами реакции
ДСН-электрофорез в полиакриламидном геле
Приготовление экстракта клеток E
Определение АТР-азной активности
Полное карбоксиметилирование ГАФДК
Определение константы седиментации
Компьютерный анализ
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Отбор моноклональных антител
Выделение комплекса антитело - антиген при помощи
высокоэффективной жидкостной хроматографии
Взаимодействие различных олигомерных форм ГАФДК с
моноклональными антителами
Получение иммобилизованных олигомерных форм ГАФДк

Количественное определение антител, связавшихся с
иммобилизованным антигеном
Анализ взаимодействия различных олигомерных форм антигена с моноклональными антителами при помощи
ДСН-электрофореза в ПААГ
Влияние антител на активность ГАФДк
Влияние антител mAbs 6С5 на термоинактивацию ГАФДк
Влияние антител на разворачивание ГАФДк в мочевине
Влияние антител на спонтанную ренатурацию Г АФДк
Очистка растворов ГАФДК от денатурированных примесей
Конкуренция за связывание с мономером ГАФДК между
mAbs 6С5 и GroEL
Взаимодействие белков из экстракта E. coli с
иммобилизованными олигомерными формами ГАФДК
Конкуренция GroEL и mAbs 6С5 за связывание с мономером
ГАФДк
Взаимодействие ГАФД из Bacillus stearothermophilus с
антителами mAbs 6С5
Взаимодействие нативной и денатурированной ГАФДВй с
иммобилизованными антителами
Взаимодействие димеров и мономеров ГАФДВ5( с антителами... 103 Предварительная характеристика вероятного эпитопа, взаимодействующего с антителами mAbs 6С5
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

тубулином связываются димеры и тетрамеры белка, однако сборка микротрубочек происходит только при взаимодействии с тетрамерами. При связывании с тубулином происходит потеря ферментативной активности (Muronetz, V. I. et al., 1994). Сборка микротрубочек полностью ингибировалась добавлением в среду 1 мМ АТР. Известно, что в присутствии АТР происходит диссоциация ГАФД на димеры и мономеры, сопровождающаяся потерей активности (Constantinides, S. М. and Deal, W. С., 1969). В этой связи представляется вероятным предположение, что в зависимости от присутствия АТР в клетке происходит переключение ГАФД с выполнения одной функции на другую.
Как было упомянуто выше, для ГАФД характерна самая разная локализация в клетке: в цитозоле, в ассоциации с мембранами, а также в ядре. Впервые предположения о выполнении ферментом роли транспортного белка тРНК были высказаны в работе Сигна и Грина (Signh, R. and Green, М. R., 1993). Дальнейшее изучение вопроса подтвердило эти данные. Выяснилось также, что связывание тРНК (Phe) ГАФД из мышц кролика не приводит к существенным изменениям вторичной структуры белка. Скорее всего нуклеиновая кислота "погружается" в полость тетрамера вдоль R и Р осей. При этом происходит нековалентное взаимодействие между остаткам ароматических аминокислот и нуклеотидными основаниями, а также ионные взаимодействия положительно заряженных аминокислотных остатков с фосфатными группировками РНК (Carmona, P., et al, 1999).
Вопрос о том, как ГАФД попадает в ядро остается открытым. Установлено, что белки < 45 кДа не нуждаются в активном транспорте для перемещения в ядро (Yoneda, Y., 1997). В ядре млекопитающих было обнаружено присутствие мономера 37 кДа, т. е. возможно, что ГАФД переходит в ядро в виде мономера (Cool, В. L. and Sirover, М.