Структурные перестройки, происходящие в миозиновой головке при взаимодействии с нуклеотидами и F-актином

• Автор: Пономарев, Михаил Александрович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 152 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Список сокращений
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Структура и основные свойства миозина
1.1.1. Разнообразие миозинов и их общие черты
1.1.2. Фрагменты, получаемые при расщеплении миозина II протеолитическими ферментами
1.1.3. АТРазная активность миозина
1.2. Структура миозиновой головки
1.2.1. Первичная структура тяжелой цепи S1 из скелетных мышц
1.2.2. Третичная структура тяжелой цепи S1 из скелетных мышц
1.3. Цикл работы миозиновой головки. Гипотеза "Lever arm"
1.4. Структурные перестройки, происходящие в миозиновой головке в ходе АТРазной реакции
1.5. Взаимодействие миозина с актином
1.5.1. Структура и основные свойства актина
1.5.2. Кинетическая схема взаимодействия миозина и актина
1.5.3. Свойства поверхности взаимодействия миозиновой головки с актином

1.6. Применение метода дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) для изучения структурных перестроек миозиновой головки
1.6.1. Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия как метод изучения структуры белков
1.6.2. Принципы регистрации данных и устройство прибора
1.6.3. Информация, получаемая из калориметрического эксперимента
1.6.4. Применение метода ДСК для изучения структуры S1
1.6.5. Применение метода ДСК для изучения структурных перестроек, происходящих в S1 при взаимодействии с нуклеотидами
1.6.6. Применение метода ДСК для исследования изменений тепловой денатурации S1, вызываемых взаимодействием с актином
1.6.6.1. Тепловая денатурация актина
1.6.6.2. Тепловая денатурация комплексов миозиновой головки с актином 63 Экспериментальная часть
2. Материалы и методы

2.1. Выделение миозина из быстрых скелетных мышц кролика
2.2. Получение субфрагмента 1 миозина
2.3. Выделение актина из ацетонового порошка
2.4. Полимеризация актина и стабилизация Е-актина фаллоидином или фторидом бериллия
2.5. Определение АТРазной активности миозина и
2.6. Электрофорез в полиакриламидном геле с БББ-Ма
2.7. Определение концентрации белков методом Бредфорд
2.8. Модификация остатка Суз-707 в
2.9. Модификация остатка Суз-697 в Б1
2.10. Формирование стабильных тройных комплексов 81 и рекомбинантных форм миозиновой головки из Dictyostelium (Иясо1с1еит с АБР и аналогами Р (Уь ВеРх, А1Е4-, 8сЕх)
2.11. Формирование комплексов Б1 и рекомбинантных форм миозиновой головки из Dгctyostelium <И8со1с1еит с Е-актином в состоянии сильного связывания
2.12. Исследования методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии (ДСК)
2.13. Исследования методом спектроскопии электронного парамагнитного резонанса (ЭПР)
3. Результаты и их обсуждение
3.1. Химические модификации БН-групп остатков Суз-697 и Суз-707 в
молекуле
3.1.1. Специфические модификации 8Н1- и 8Н2-групп в 81. Исследования методом ДСК
3.1.2. Специфические модификации БШ-группы Б1 спиновыми метками. Исследования методом ЭПР
3.2. Калориметрические исследования фрагментов миозиновой головки из Dгctyostelium сИ8со{с1еит
3.2.1. Калориметрические исследования фрагментов М754, М765, М765-Ш, М765-211 и М864 в отсутствие нуклеотидов
3.2.2. Тепловая денатурация фрагментов миозиновой головки из
Dictyostelium сИ8со{<1еит в комплексах с АВР и аналогами фосфата
3.2.3. Влияние связывания АБР на тепловую денатурацию фрагмента М765 из ОуозЬеИит сИ8со{Леит и скелетномышечного Б1

3.3. Исследования методом ДСК доменной организации 81 в отсутствие и в
присутствии АВР
3.4. Исследования методом ДСК комплексов миозиновой головки с Е-актином
3.4.1. Взаимодействие с Е-актином фрагмента М765 с изменениями в актин-связывающей петле
3.4.2. Влияние условий среды на взаимодействие 81 и М765 с Е-актином

3.4.3. Взаимодействие 81 с С-актином
3.4.4. Взаимодействие с Е-актином препаратов 81, специфически модифицированных по существенным ЭН-группам
Заключение
Выводы
Список литературы
Благодарности

Сравнение структур тройных комплексов гладкомышечных MD и MDE с ADP и фтористым алюминием со структурой скелетномышечного S1 без связанных нуклеотидов, полученной группой Раймента [Rayment et al., 1993а], дает возможность выявить влияние существенных легких цепей на перестройки, происходящие при образовании тройных комплексов [Dominguez et al., 1998]. Наиболее заметна разница между тройными комплексами, сформированными фрагментами MD и MDE, в С-копцевой части (только в конверторе для MD и в конверторе вместе с регуляторным доменом для MDE). Начиная с консервативного остатка Gly-720 положение конвертора различается между MD и MDE поворотом как единого целого на 10°. Это вызвано стерическими факторами взаимодействия моторного домена с существенной легкой цепью. Для обоих фрагментов миозиновой головки (MD и MDE) положение конвертора и жестко связанного с ним регуляторного домена сильно отличается от структуры скелетномышечного S1, в то время как общая организация а-спирали регуляторного домена и ассоциированной с нею существенной легкой цепи одинакова для MDE и S1.
В тройном комплексе MDEADPAIF4' по сравнению со свободным от нуклеотидов скелетным S1 С-концевая часть, начиная с остатка GIy-709 (по первичной последовательности гладкомышечного S1), расположеного между существенными SH-группами, смещена на 70° градусов. Общий поворот осуществляется за счет двух поворотов на консервативных остатках глицина 709 и 720 в области существенных SH-групп. В результате конвертор и жестко связанный с ним регуляторный домен поворачиваются по часовой стрелке (если смотреть вдоль оси а-спирали, содержащей SHl-группу, от ее С-конца к N-концу) (рис. 5 D,F). Такой поворот изменяет участки взаимодействия существенной легкой цепи и тяжелой цепи моторного домена, т. е. в тройном комплексе MDE ADP AIF4” существенная легкая цепь взаимодействует с так называемой петлей 1 (остатки Ala-198 - Lys-205 по последовательности гладкомышечного S1), а не с N-концом тяжелой цепи в случае скелетного S1, свободного от нуклеотидов.
Далее мы несколько подробнее опишем предполагаемый механизм передачи конформационных изменений от активного центра АТРазы миозиновой головки на ее регуляторный домен. Как уже указывалось в разделе 1.2.2., связка между верхним и нижним доменами (Switch И)