Создание химиотерапевтических противоопухолевых систем направленного действия с использованием белковых факторов

• Автор: Луценко, Сергей Викторович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 247 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Са2 Дкальмодулин-зависимые протеинкиназы и их субстраты
1.1.1. Кальций как вторичный мессенджер
1.1.2. Кальмодулин - универсальный клеточный модулятор
1.1.2.1. Распространение кальмодулина
1.1.2.2. Физико-химические свойства кальмодулина
1.1.2.3. Механизм действия кальмодулина
1.1.3. Са2 ‘Укал ь м одул ин-завис и м ы е протеинкиназы
1.1.4. Субстратные белки Са2+/кальмодулин-зависимых протеинкиназ
1.1.4.1. Нейроспецифический белок синапсин I
1.1.4.2. Другие субстратные белки
1.2. Рецепторопосредованный эндоцитоз
1.2.1. Процессинг ЭФР-рецепторных комплексов
1.2.1.1. Мембранный этап процессинга ЭФР
1.2.1.2. Интернализация ЭФРРК
1.2.1.3. Внутриклеточная компартментализация ЭФРРК
1.2.1.4. Биохимический процессинг ЭФРРК
1.2.2. Создание цитотоксических систем направленного действия с использованием рецепторопосредованного эндоцитоза в качестве транспортного механизма
1.2.2.1. Преимущества и недостатки использования СНД
1.2.2.2. Ковалентное связывание
1.2.2.3 Нековалентное связывание
1.2.2.4. Критические параметры для использования СНД
1.2.2.5. Внутриклеточный транспорт ХП, ковалентно связанного с
вектором
1.2.2.6. Внутриклеточный транспорт ХП, нековалентно связанного с вектором
1.2.3. Общие характеристики векторных белков

1.2.3.1. Альфа-фетопротеин
1.2.3.2. Эпидермальный фактор роста
1.2.3.2.1. Структура и физико-химические свойства ЭФР
1.2.3.2.2.Видоспецифичность ЭФР
1.3. Рекомбинантные белки
1.3.1. Векторы, используемые для экспрессии
1.3.2.Методы экспрессии
1.3.3. Методы лизиса клеток
1.3.4. Нерастворимые белки
1.3.5. Растворимые белки
1.3.6. Дополнительные проблемы, связанные с выделением рекомбинантных белков
1.4. Цитокины
1.4.1. Терапевтический потенциал цитокинов
1.4.2. Применение ИЛ-4 при лечении онкогематологических
заболеваний
1.4.3. Локальное применение цитокинов
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Выделение и изучение свойств Са2+, кальмодулинзависимой протеинкиназы П из мозга крысы
2.1.1. Выделение ПК П
2.1.2. Определение активности ПК II
2.1.3. Определение автофосфорилирования ПК П
2.1.4. Влияние автофосфорилирования на активность ПК II
2.1.5. Определение молекулярной массы и радиуса Стокса ПК II
2.1.6. Связывание 1251-кальмодулина с полипептидами ПК П
2.1.7. Электрофорез препаратов ПК П
2.2. Выделение и изучение некоторых физико-химических свойств синапсина I из мозга морской свинки
2.2.1. Выделение синапсина!
2.2.2. Электрофорез препаратов синапсина I
2.2.3. Определение молекулярной массы и радиуса Стокса синапсина I

2.2.4. Определение базальной активности каталитической субъединицы сАМР-зависимой протеинкиназы
2.2.5. Фосфорилирование синапсина I
2.2.6. Определение аминокислотного состава синапсина I
2.3. Связывание синапсина I с тубулином и кальмодулином
2.3.1. Связывание синапсина I с 1251-меченым кальмодулином и 1251-меченым тубулином на нитроцеллюлозных фильтрах
2.3.2. Количественная характеристика связывания синапсина I с 1251-меченым кальмодулином и 1251-меченым тубулином
2.4. Получение и изучение свойств систем направленного транспорта
на основе АФП и ЭФР
2.4.1. Выделение и очистка АФП
2.4.2. Выделение и очистка ЭФР
2.4.3. Получение систем направленного действия (СНД), включающих химиопрепараты и векторные белки (ЭФР и АФП). 108 2.4 .3 .1. СНД на основе ЭФР и АФП (СНДэфр и _афп), включающие
ФЦ(А1), ФЦ(Со) и Вк
2.4.3.2. СНДэфр и _афп, включающие Др, Км и Вб
2.4.3.3. СНДэфр и _афп, включающие XJI pg и XJI вб
2.4.4. Культивирование клеток
2.4.5. Определение цитотоксической активности препаратов in vitro
2.4.5.1. ЦТА СНДэфр и _афп , включающих ФЦ(А1), ФЦ(Со), ХЛ ре, XJI
ей и свободных химиопрепаратов
2.4.5.2. СНДэфр и .дфп, включающих антрациклиновые антибиотики и растительные алкалоиды
2.4.5.3. Оценка жизнеспособности клеток
2.4.6. Исследование накопления и внутриклеточного распределения СНДэфр, включающих доксорубицин и карминомицин и свободных антрациклиновых антибиотиков
2.4.7. Определение биологической активности ЭФР и ЭФРФР
2.4.7. Противоопухолевая активность СНД in vivo
2.4.8. Дозы препаратов и схемы их введения
2.4.8.1. СНДэфр и _афп, включающие фталоцианины

1.1.4.2. Другие субстратные белки
Тирозингидроксилаза, фермент, участвующий в биосинтезе катехоламинов, была выделена из мозга, adrenal medulla и клеток феохромацитомы [Markey 1980; Vulliet 1980; Lazar 1982]. Фермент состоит из четырех субъединиц с молекулярной массой 60 кДа [Okuno 1982]. Действие нервного импульса или нейротрансмиттера на нервную клетку вызывает увеличение скорости биосинтеза катехоламинов в результате повышения каталитической активности тирозингидроксилазы [Salzman 1978].
На клетках феохромацитомы крысы было показано, что в ответ на действие стимулирующего агента ПК II осуществляет фосфорилирование тирозингидроксилазы [Griffith 1988], тогда как сАМР-зависимая и Са2+/фосфолипид-зависимая протеинкиназы способны фосфорилировать ее лишь in vitro [Joh 1978; Raese 1981].
Повышение активности триптофангидроксилазы в результате действия на клетку нервного импульса приводит к увеличению скорости биосинтеза серотонина [Нашоп 1981]. Полагают, что активация триптофангидроксилазы опосредуется через ее фосфорилирование Са2'/кальмодулин-зависимыми протеинкиназами [Yamauchi 1983], но прямая зависимость активации триптофангидроксилазы от фосфорилирования in vivo не выявлена.
Одним из элементов цитоскелета нервных клеток, играющих важную роль в клеточной морфологии и внутриклеточных транспортных процессах, являются микротрубочки, содержащие тубулин, МАР-2 и семейство т-белков. МАР-2, выделенный из мозга, представляет собой единичную полипептидную цепь с молекулярной массой 300 кДа [Sloboda 1975]. Предполагается, что этот белок участвует в сборке микротрубочек in vivo, так как он повышает скорость и степень полимеризации тубулина in vitro [Kim 1979]. Несколькими группами исследователей было показано, что Са2+/кальмодулин-зависимые протеинкиназы фосфорилируют MAP-2 in vitro [Lai 1983; Okuno 1982]. В то же время Са2+ и кальмодулин оказывают влияние на процесс сборки микротрубочек in vivo [Yamauchi 1982; Purich 1981]. По-видимому, этот эффект опосредуется через фосфорилирование МАР-2 Са2+/кальмодулин-зависимыми протеинкиназами. При фосфорилировании ПК II включает 5 молей фосфата в моль МАР-2, а кажущаяся Км составляет 0,2 мкМ [Yamauchi 1982]. Интересно