Особенности апоптоза и его регуляция в различных опухолевых клетках человека

• Автор: Сладкова, Лариса Вячеславовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 116 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Список сокращений с.З
Введение с.4
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Особенности проявления апоптоза.
1.1.1. Типы клеточной гибели.
1.1.2. Структурные изменения хроматина и фрагментация ДНК при апоптозе
1.2. Методы регистрации апоптоза.
1.3. Механизмы индукции апоптоза при действии противоопухолевых
препаратов.
1.4. Регуляция процесса апоптоза белками семейства Вс1-2. с.ЗО
1.4.1. История открытия белка Вс1-2. с.ЗО
1.4.2. Структурно-функциональные особенности белков семейства Вс1-2. с.ЗЗ
1.4.3. Роль Вс1-2 в регуляции апоптоза. с.36
1.4.4. Регуляция антиапоптотической активности белка Вс1-2. с.40
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. с.44
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. с.62
3.1. Анализ особенностей проявления апоптоза в опухолевых клетках с.62 - 74 человека различных клеточных линий.
3.2. Исследование уровня экспрессии гена Ьс1-2 в клетках с.74 - 76 различных В-клеточных линий.
3.3. Исследование чувствительности В-клеточных линий человека с.76 - 79 к противоопухолевым препаратам.
3.4. Анализ корреляции чувствительности различных линий клеток с.79 - 82 к противоопухолевым препаратам с уровнем экспрессии Вс1-2.
3.5. Анализ корреляции продолжительности клеточного цикла с.82 - 84 с уровнем экспрессии Вс1-2.
3.6/Изучение устойчивости клеточных линий к противоопухолевым
препаратам и скорости пролиферации при трансфекции гена Ьс1-2.
3.7. Регуляция устойчивости опухолевых клеток к противоопухолевым
препаратам с помощью антисмысловых олигонуклеотидов (АСОН) к гену Ьс1-2.
Заключение.
Выводы.
Список литературы.
Приложение.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
БСА - бычий сывороточный альбумин дНТФ - динуклеотидтрифосфат
МТТ - 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенил-тетрозолий бромид DMSO - диметилсульфоксид
ХТТ - 2,3-бис[2-метил-4-нитро-5-сульфофенил]-2Н-тетразолий-5-карбоксонилид РТР - permeability transition роге, пора временной проницаемости митохондрии ТМ - трансмембранный домен
RT - reverse transcription, реакция обратной транскрипции
PCR - polymerize chain reaction, полимеразная цепная реакция
PMSF - фенилметилсульфонил фторид
ФСБ - фосфатно-солевой буфер
СКС - сыворотка крупнорогатого скота
АСОН - антисмысловая олигонуклеотидная последовательность СОН - случайная олигонуклеотидная последовательность ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцианат
IC50 - концентрация препарата, вызывающая гибель 50% клеток EBV - вирус Эпштейн-Барр
TUNEL - terminal deoxyribonucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling, реакция включения дезоксинуклеотидил трансферазой меченого дезоксиуридинтрифосфата в места разрывов ДНК
т.п.о. - тысяч пар оснований (нуклеотидов)
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК - рибонуклеиновая кислота
Р1 - пропидий йодид
АТФ - аденозинтрифосфат
дАТФ -дезоксиаденозинтрифосфат
SDS - додецилсульфат натрия
DTT - дитиотрийтол

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Апоптоз представляет собой программированный процесс гибели клетки, с помощью которого многоклеточный организм без повреждения окружающих тканей освобождается от ненужных и поврежденных клеток. Поэтому апоптоз играет важную роль в регуляции эмбрионального развития и поддержания гомеостаза тканей. Нарушение регуляции апоптоза в различных тканях приводит к тяжелым патологическим последствиям. В частности, ингибирование процессов апоптоза лежит в основе злокачественной трансформации клеток и в возникновении опухолей невосприимчивых к химиотерапевтическим препаратам, так как практически все известные препараты вызывают гибель опухолевых клеток через индукцию апоптоза.
В процессе апоптоза происходят сложные морфологические и биохимические изменения: уменьшение объема клетки, вакуулизация цитоплазмы, конденсация хроматина и фрагментация ядра ( Kerr, Will, 1972 ). Условно выделяют три стадии апоптоза. Первая фаза - фаза индукции - связана с передачей сигнала и активацией каспаз. Следующая фаза -фаза разрушения - представляет собой последовательность событий, приводящих к деструкции клеточного аппарата. Фаза элиминации связана с удалением апоптотических клеток макрофагами или клетками окружающих тканей. Апоптоз может быть блокирован при участии белков семейства Вс1-2 на стадиях, предшествующих активации каспаз и кроме того, семейством ингибирующих апоптоз белков (IAP) после их активации. Семейство Вс1-2 состоит из антиапоптотических белков, таких как Вс1-2 и Вс1-Х1, и проапоптотических, таких как Вах и Вак и др. и насчитывает более 25 членов. Члены этого семейства способны образовывать гомо- и гетеродимеры, что регулирует их активность наряду с процессами фосфорилирования. Усиление активности проапоптотических белков в клетке приводит к индукции апоптоза, гиперэкспрессия антиапоптотических белков блокирует этот процесс. Вс1-2 является наиболее хорошо изученным среди названных выше белков. Открытие гена

индукцию апоптоза [127]. Кроме того, введение ВНЗ домена белка Вах в белок Вс1-2 превращает этот белок из ингибитора в индуктор апоптоза [128]. Такие проапоптотические белки как Bid, Bik и Bim содержат только ВНЗ домен, но не домены ВН1, ВН2 или ВН4,
Мутационный анализ области ВНЗ домена показал, что проапоптотичсская активность ВНЗ домена регулируется с помощью образования гетеродимеров с про- или антиапоптотическими белками. Например, ВНЗ домен белка Bid участвует в образовании гетеродимеров как с Вс1-2 так и с Вах. Однако мутантный Bid сохранял способность связываться с Вах, но не с Вс1-2 и проявлял проапоптотические функции [129], в то время как для проявления функций проапоптотического белка Bad необходимым условием является связывание ВНЗ домена с белком Вс1-2 [130].
Четвертый домен ВН4 находится в N-концевой области белков и обнаружен только у антиапоптотических белков. Исключение составляет проапоптотический белок Bcl-Xs, который образуется в результате альтернативного сплайсинга Bcl-Х. Домен ВН4 необходим для взаимодействия Вс1-2 или Bc1-Xl с белками регуляторами апоптоза, которые по структуре не принадлежат семейству Вс1-2. К этим белкам относятся Raf-1 [131], Ced-4 [132], кальцинейрин [133]. Делеция домена ВН4 в белке Вс1-2 не только приводила к потере антиапоптотической активности этого белка, но и обращала свойства этого белка, делая его индуктором апоптоза [134]. Кроме того, обнаружены модифицированные молекулы Вс1-2 без ВН4 домена, которые образуются в результате каспазного расщепления в процессе апоптоза. И показано, что эта модификация значительно усиливает развитие апоптоза [135].
Некоторые белки семейства Вс1-2 на С-концевой последовательности содержат несколько гидрофобных аминокислот. Этот участок является трансмембранным доменом (ТМ) и определяет не только способность белков встраиваться в мембрану различных органелл, но свойства и функции этих белков. Делеция трансмембранного домена Вс1-2 снижала или полностью нарушала антиапоптотические свойства Вс1-2 [9], и, кроме того,