Мониторинг образования и распада комплексов водорастворимого и мембранных цитохромов Р450 с их редокс-партнерами в реальном времени

• Автор: Иванов, Юрий Дмитриевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 313 с. : ил

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ACM атомно-силовая микроскопия
БФ бензфетамин
КР К-фосфатный буфер
КР/Е К-фосфатный буфер, содержащий 0.25 г/л эмульгена
ММС микросомальная монооксигеназная система
MPC мономерная реконструированная система
СТМ сканирующая туннельная микроскопия
ТХУ трихлоруксусная кислота
Ad адренодоксин
AdR адренодоксин редуктаза
Ь5 цитохром Ь
d-b5 цитохром Ь5, выделенный с помощью детергентов
t-b5 цитохром Ь5, выделенный с помощью протеаз
EDC 1 -этил-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид
FAD флавинаденкндинуклеотид
FMN флавинмононуклеотид
NADPH никотинамидадениндинуклеотидфосфат
восстановленный NADH никотинамидадениндинуклеотид восстановленный
NHS N- гидроксисукцинимид
Fp- NADPH -цитохром Р450 редуктаза
NADPH-специфичный флавопротеин d-Fp - NADPH-специфичный флавопротеин, выделенный с
помощью детергентов t-Fp - NADPH-специфичный флавопротеин, выделенный с

помощью протеаз Р450 цитохром Р
Р4502В1 цитохром Р450, подфракция 2В
Р4502В4 цитохром Р450, подфракция 2В
(3-2В4 нативная форма цитохрома Р4502В
1>2В4 рекомбинантная форма цитохрома Р4502В4, с
делецией А2-27 М-концевого домена Р450сат цитохром Р450саш
Р450зсс цитохром Р450зсс
Рс1 путидаредоксин
Рс1К путидаредоксин редуктаза
Кб константа диссоциации
Кр константа равновесия
коп константа скорости реакции ассоциации комплексов
к0д- константа скорости реакции диссоциации комплексов
т время жизни комплексов

СОДЕРЖАНИЕ

Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Г лава 1. Общие представления о молекулярной организации электрон-транспортных цепей в Р450-содержащих монооксигеназных системах, и новые методы
исследования взаимодействия биообъектов
1 1. Молекулярная организация электрон-транспортной цепи Р450сат-содержащей монооксигеназной системы
1.2. Молекулярная организация электрон-транспортной цепи митохондриальной Р450зсс-содержащей монооксигеназной системы
1.3. Микросомальная Р450 2В4-содержащая моноокригеназная система
1.3.1. Молекулярная организация электрон-транспортной цепи микросомальной Р450 2В4-содержащей монооксигеназной системы
1.3.2. Моделирование липид - белковых взаимодействий в мембранной Р450-содержащей системе
1.4. Новые методы определения параметров комплексообразования биомолекул
1.4.1. Метод оптического биосенсора для исследования взаимодействия биомолекул в реальном масштабе времени

разованию комплексов Ad/P450scc. В [Радюк и др, (1993)] была конструирована более простая цитохром P450scc- содержащая шооксигеназная система в 50 мМ натрий -фосфатном буферном створе, pH 7.2 , не содержащая детергентов или фосфолипидов, в торой один из белков - Ad был иммобилизован. Эта система обладала лестерингидроксилирующей активностью, поэтому в диссертационной йоте взаимодействие редокс партнеров P450scc -содержащей системы :следовалось в буферном растворе , не содержащем детергентов или зсфолипидов в условиях, когда один из партеров иммобилизовался к )ВерХНО"СТИ измерительной кюветы.
заимодействие P450scc с Ad
В литературе имеются две точки зрения на роль гидрофобных и юктростатических взаимодействий в образовании комплексов P450scc с d. Согласно одной из них образование этих комплексов определяется гектростатическими взаимодействиями. Так было показано, что P450scc оразуют бинарные комплексы с Ad, причем комплексообразование утцественно зависит от ионной силы буфера, что указывает на важную оль электростатических взаимодействий в образовании бинарных P450scc d и определяется взаимодействием отрицательно заряженных арбоксигрупп Ad с положительно заряженными группами P450scc Lambeth and Kriengsiri, (1985)]. Константа равновесия, измеренная для инарных комплексов Ad/P450scc разными авторами существенно не азличалась и составляла 1.2 -10б М'1, [Coghlan and Vickery, (1991)], 5.3 • 0б М'1 [Katagiri et al., (1977)], 106 M [Lambeth and Kriegsiri,( 1985)], 7.5-06M "’[Tuls et al., (1987)]. Небольшие различия в значении константы »авновесия могут быть связаны с различием в составе используемых »уферных растворов. Существенную роль в комплексообразовании P450scc