Исследование кинетики превращений ДНК под действием ДНК-топоизомераз и ДНК-абзимов

• Автор: Фаворов, Петр Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 114 с.

Содержание
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Природные каталитические антитела
2. ДНК-ТОПОИЗОМЕРАЗЫ: СТРУКТУРА, МЕХАНИЗМ И ЭФФЕКТОРЫ
2.1. Классификация топоизомераз
2.2. Топоизомеразы 1-5’
2.3. Топоизомеразы 1-3’
2.4. Топоизомеразы II
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. МАТЕРИАЛЫ
2. Методы
2.1. Выделение и очистка фракции иммуноглобулинов G
2.2. Выделение ядерного матрикса и приготовление аффинного сорбента на основе белков ядерного матрикса
2.3. Реакция релаксации суперскрученной плазмидной ДНК
2.4. Выделение плазмидной ДНК
2.5. Электрофорез в агарозном геле
2.6. Культура эукариотических клеток и анализ цитотоксического эффекта антител
2.7. Метод линейного дихроизма
2.8. Разделение Fab и Fc фрагментов иммуноглобулинов G
2.9. Изучение кинетики реакции ДНК-абзимов методом ЛД
2.10. Исследование кинетики топоизомеразной реакции методом ЛД
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Исследование функциональных свойств аутоантител, связывающихся с белковыми компонентами ЯДЕРНОГО матрикса
1.1. Гидролиз ДНК под действием матрикс-связывающих аутоантител
1.2 Цитотоксическое действие матрикс-связывающих аутоантител
2. Кинетические исследования взаимодействия ДНК-абзимов и ДНК-топоизомераз с ДНК МЕТОДОМ измерения линейного дихроизма в потоке
2.1 Линейный дихроизм и топология ДНК
2.2 Изучение кинетики гидролиза ДНК, катализируемого аутоантителами, связывающимися с белковыми компонентами ядерного матрикса
2.3 Исследование кинетики топоизомеризации плазмидной ДНК эукариотическими топоизомеразами I и II
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений
АМРРЫР аденозин-5’-фосфат- Р,у-иминодифосфат
АТР аденозин-5’-трифосфорная кислота
НРЬС высокоэффективная жидкостная хроматография
ІЯСг иммуноглобулин й
ЬІБ 3,5-дииодсалицилат лития
мтт 3(4,5-диметилтиазол-2ил)2,5-дифенилтетразолиум бромид
БББ додецилсульфат натрия
БСА бычий сывороточный альбумин
вип вазоактивный интестинальный пептид
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
лд линейный дихроизм
ПААГ полиакриламидный гель
РНК рибонуклеиновая кислота
СКВ системная красная волчанка
Трис, Тгіб т/жс-гидроксиметиламинометан

Введение
Различные превращения ДНК являются важнейшими процессами, обеспечивающими жизнедеятельность организма. Всестороннее исследование таких процессов не только проливает свет на нормальное функционирование клеточного аппарата, но и способно объяснить возникновение и механизм многих заболеваний.
Одним из относительно недавних открытий в этой области стало обнаружение антител, способных катализировать гидролиз ДНК. Изучение ДНК-гидролизующих антител является одной из интересных областей современной биохимии и иммунологии. Исследование каталитических свойств антител интересно как с точки зрения решения фундаментальных проблем биокатализа расшифровки механизмов катализа физиологически важных реакций, так и для прикладных разработок, направленных на создание новых устойчивых биокатализаторов, способных включать и выключать различные процессы метаболизма. Однако, роль природных каталитических антител в аутоиммунном процессе и механизмы,
вызывающие продукцию этих антител, не определены. Одним из возможных путей возникновения таких антител может быть аутоиммунная реакция организма на ДНК-белковые комплексы, в которых ДНК находится в напряженной конформации, напоминающей конформацию переходного состояния реакции гидролиза
фосфодиэфирной связи. Такие комплексы могут находиться, например,
в составе ядерного матрикса - наиболее прочного ДНК-белкового ансамбля эукариотической клетки.
Огромное значение для развития биохимии и широкие
перспективы в биомедицине имеет и изучение механизма действия ферментов топоизомеризации ДНК и их эффекторов. Так как эти ферменты обеспечивают в живой клетке упорядоченное хранение и нормальную передачу генетической информации следующим поколениям, понимание их функционирования очень важно для фундаментальной науки. Кроме того, уже сейчас селективное

К-2 К-І

камптотецин (Я і,2,з,4=Н)
БЫ-Зв (Яг.4=Н, ИСНгСНз, И3=ОН)

он £

карбоксилат
21 -лактам-20-8-СРТ 20-ІЧ-СРТ
лактон
Рис. 2. Камтотецин и его аналоги
б. Мутации гена топоизомеразы I, ведущие к камптотециновой устойчивости.
Большинство мутаций гена топоизомеразы I, ведущих к изменению способности СРТ влиять на активность фермента, находятся в непосредственной близости от последовательности, кодирующей каталитический остаток тирозина, что подтверждает гипотезу о связывании СРТ с активным центром фермента. Другие мутации локализованы в районах, которые оказываются сближены с каталитическим центром в результате укладки белковой молекулы. Однако, надо отметить, что клинически наблюдаемая устойчивость опухолей к лекарственным препаратам камптотецинового ряда объясняется, чаще всего ,не подобными заменами , а пониженным уровнем экспрессии топоизомеразы I в таких клетках.
в. Зависимость между структурой и активностью камптотециновых производных.
СРТ представляет собой плоскую изогнутую молекулу. Несмотря на такую форму, СРТ не способен интеркалировать ДНК. Методом иУ-