Взаимодействие белка теплового шока с молекулярной массой 90 кДа (Hsp90) с некоторыми сократительными и цитоскелетными белками

• Автор: Ма Юйшу
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 160 с. : ил.

Оглавление
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Строение и свойства белков теплового шока
1.1. Общая характеристика белков теплового шока
1.2. Регуляция синтеза белков теплового шока
1.3. Классификация белков теплового шока и некоторые свойства белков теплового шока с молекулярными массами 60 кДа (ЪлрбО) и
70 кДа (Ьр70)
1.3.1. НврбО (шаперонины)
1.3.2. Нвр70
1.4. Белки теплового шока с молекулярной массой 90 кДа (Ьзр90)
1.4.1. Доменная структура Ьзр90
1.4.2. Строение И-концевого домена Ььр90: Шаперонная активность, связывание АТФ и антибиотиков ансамицинового ряда
1.4.3. С-концевой домен Ьзр90: Шаперонная активность и олигомеризация
1.4.4. Строение фолдосомы («шаперонной машины») и белки-партнеры Ьзр90
1.4.5. Взаимодействие йзр90 с различными белками-субстратами
а) Взаимодействие Ьзр90 с рецепторами стероидных гормонов
б) Взаимодействие 1кр90 с протеинкиназами
в) Взаимодействие Ьзр90 с белками цитоскелета
2. БЕЛКИ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ ФИЛАМЕНТОВ
2.1. Классификация белков промежуточных филаментов
2.2. Десмин
3. СОКРАТИТЕЛЬНЫЙ АППАРАТ КЛЕТКИ
3.1. Молекулярные механизмы сократительной активности различных типов мышц и пути ее регуляции
3.2. Калъпонин — регуляторный и цитоскелетный белок
гладких мышц
3.2.1. Физико-химические свойства кальпонина
3.2.2. Доменная структура кальпонина
3.2.3. Взаимодействие кальпонина с различными белками
а). Взаимодействие кальпонина с актином
б). Взаимодействие кальпонина с тропомиозином
в). Взаимодействие кальпонина с кальций-связывающими белками
г). Взаимодействие кальпонина с другими белками и возможное участие кальпонина в перемещении протеинкиназ внутри клетки

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Методы получения белков
1.1. Выделение белка теплового шока с молекулярной массой 90 кДа (hsp90) из печени кролика
1.2. Выделение калъпоиина из мускульных желудков уток
1.3. Выделение актина из ацетонового порошка скелетной мышцы кролика
1.4. Выделение десмина из мускульных желудков уток
1.5. Препараты кальдесмона, тропомиозина и компонентов тропонина
2. Методы получения пептидов
2.1. Фрагментация полипептидной цепи hsp90
2.1.1. Ограниченный трипсинолиз hsp90
2.1.2. Получение фосфорилированных пептидов hsp90
2.2. Ограниченный химотрипсинолиз калъпонина
3. Методы изучения белок-белковых взаимодействий
3.1. Метод «нулевой сшивки»
3.2. Нативный электрофорез
3.3. Хроматография по сродству
3.4. Методы центрифугирования и соосаждения
3.5. Оптические методы исследования
3.5.1. Светорассеяние
3.5.2. Флуоресцентная спектроскопия
3.6. Электронная микроскопия
4. Некоторые аналитические методы
4.1. Методы переноса белков с полиакриламидного геля на нитроцеллюлозу
4.1.1. Иммуноблоттинг
4.1.2. Метод переноса пептидов на мембраны Иммобилон
4.2. Определение молекулярной массы белка с помощью метода нативного электрофореза
4.3. Прокрашивание геля серебром
4.4. Определение концентрации белков
4.4.1. Спектрофотометрический метод
4.4.2. Определение концентрации белка по методу Спектора [Spector, 1978]
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Выделение белка теплового шока с молекулярной массой
90 кДа (HSP90) из печени кролика
2. Предварительный анализ взаимодействия hsp90 с различными сократительными и регуляторными белками
2.1. Изучение взаимодействия hsp90 с десмином
2.2. Использование метода «нулевой» химической сшивки для скрининга белков, способных взаимодействовать с hsp90

3. Изучение взаимодействия нзр90 с кальпонином
3.1. Использование метода нативного электрофореза в полиакриламидном геле для определения олигомерного состояния кзр90 и исследования его взаимодействия с кальпонином
3.2. Определение участка кальпонина, обеспечивающего его взаимодействие с Ыр90
3.3. Определение кальпонин-связывающего участка Ьзр90
3.4. Влияние фосфорилирования кяр90 на его взаимодействие с кальпонином
3.5. Влияние Ьвр90 на взаимодействие кальпонина с актином
3.5.1. Влияние Ьзр90 на вызванную кальпонином полимеризацию в-актина
3.5.2. Влияние Ьэр90 на пучкование нитей актина, вызываемое кальпонином
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

олигомеризации [Chadli et al., 1999]. В то же время добавление молибдата, наоборот, приводит к увеличению гидрофобности и способствует олигомеризации hsp90. В процессах димеризации и олигомеризации hsp90 задействованы N- и С-концевые домены hsp90 (см. выше). В этих же доменах располагаются участки связывания белков-мишеней. Вероятно, именно поэтому олигомеризация сопровождается изменением шаперонной активности hsp90 [Yonehara et al., 1996]. Нельзя исключить возможности того, что индуцированная повышением температуры олигомеризация hsp90 является особым механизмом, позволяющим регулировать шаперонную активность этого белка in vivo.
1.4.4. Строение фолдосомы («шаперонной машины») и белки-партнеры hsp90
Представленные данные свидетельствуют о том, что изолированный hsp90 обладает АТФазной активностью, способен к олигомеризации, может связывать частично денатурированные белки и пептиды и препятствует их агрегации. Однако оказалось, что помимо всех этих функций hsp90 выступает в качестве своеобразной платформы, на которой происходит сборка сложного многокомпонентного комплекса, участвующего в поддержании правильной структуры или транспортировке определенных белков к местам их функционирования. Детали сборки и функционирования фолдосомы в настоящее время интенсивно исследуются. Установлено, что состав фолдосомы дрожжей, растений и млекопитающих в целом сходен (см. табл.З).
Остановимся вкратце на основных свойствах компонентов фолдосом и их роли в функционировании этого комплекса белков.