Структурно-функциональное исследование химазоподобной протеазы - нового фермента из дуоденума быка

• Автор: Соколова, Елена Александровна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 123 с.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
I СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДУОДЕНАЗЫ И ХИМАЗ, ФЕРМЕНТОВ, СТРУКТУРНО РОДСТВЕННЫХ ХИМАЗОПОДОБНОЙ ПРОТЕАЗЕ (литературный обзор)
1. Дуоденаза, сериновая протеаза эпителиоцитов бруннеровых желез
1.1. Локализация и предполагаемая биологическая роль дуоденазы
1.2. Молекулярные свойства и структура дуоденазы
1.3. Энзиматические свойства дуоденазы
2. Химазы тучных клеток
2.1. Гетерогенность и биологическая значимость тучных клеток
2.2. Тканевая локализация и молекулярные свойства химаз
2.3. Структурные особенности химаз
2.4. Упаковка и хранение химаз в секреторных гранулах
2.5. Активация предшественников химаз
2.6 Субстратная специфичность химаз
2.6.1. Синтетические субстраты
2.6.2. Полипептидные и белковые субстраты
2.7. Ингибиторы химаз
2.7.1. Синтетические ингибиторы
2.7.2. Природные ингибиторы химаз
2.8. Физиологическая роль химаз
II. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Очистка фермента
2. Критерии чистоты и молекулярные свойства фермента
3. Стабильность фермента
4. КІ-концевая последовательность СЫР
5. Влияние pH, температуры и ионной силы на активность фермента
6. Субстратная специфичность СЫР
6.1. Синтетические субстраты
6.2. Природные полипептидные субстраты
7. Ингибиторный анализ
8. Иммунногистохимическая локализация С" Р
III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Материалы
2. Методы
2.1. Очистка химазоподобной протеаэы
2.2. Определение белка
2.3. Определение активности
2.4. Определение концентрации фермента
2.5. Определение кинетических параметров гидролиза субстратов
2.6. Гидролиз белков и пептидов ChIP
2.7. Масс-спектрометрический анализ
2.8. Гель-электрофорез
2.9. Аналитические методы определения ChIP
2.10. Определение pH-зависимости ChIP
2.11. Ингибирование ChIP
2.12. Определение N-концевой последовательности белка
2.13. Получение антител к ChIP
2.14. Иммуногистохимический анализ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ
Протеолитические ферменты (протеазы), в том числе сериновые протеазы, играют важную роль в регуляции многообразных биологических процессов всех живых организмов, осуществляя модификацию биологически активных белков и пептидов и тем самым определяя начало или прекращение физиологических процессов.
Сериновые протеазы широко распространены в природе и присутствуют как в микроорганизмах, так и в высших растениях и животных, включая человека.
Все сериновые протеазы на основании данных об их пространственном строении разделяют на три семейства: химотрипсина, субтилизина и карбоксипептидазы II. Представители этих семейств берут начало от разных эволюционных предшественников и отличаются друг от друга по первичной структуре и пространственной укладке полипептидных цепей. Однако, все сериновые протеазы разными эволюционными путями пришли к одинаковому каталитическому механизму и содержат в активном центре молекулы каталитически активные остатки His, Ser и Asp в идентичной геометрической ориентации.
Семейство химотрипсина включает большое число протеаз из бактериальных и высших организмов и привлекает большой интерес исследователей. В организме они выполняют как деструктивную, так и регуляторную функции: гидролиз белковых компонентов пищи (ферменты поджелудочной железы трипсин, химотрипсин, эластаза,); посттрансляционный процессинг ферментов, гормонов, цитокинов (энтеропептидаза, калликреин, трипсин, гранзим В); участие в каскадных

РИе-диазометилкетона) происходит ингибирование процесса активации гранулоцитарных протеаз [87, 128, 129].
Murakami с соавторами предложил следующий механизм активации прохимаэы человека [125]: после отпочковывания гранул от аппарата Гольджи происходит закисление их внутренней среды, что активирует DPP 1. Дипептидилпептидаза 1, в свою очередь, активирует прохимазу, отщепляя N-концевой дипептид. Причем, реакция активации зимогена ускоряется при увеличении концентрации гепарина.
Однако, противоречащие этому механизму данные получены в работе [130], Гепарин, наоборот, ингибирует процесс активации прохимазы дипептидилпептидазой 1, и pH оптимум DPP 1 для этой реакции близок к нейтральному (-7,0). То есть, DPP 1-зависимая активация профермента может происходить только на самых ранних стадиях созревания секреторной гранулы, когда pH в ней ещё близок к нейтральному, и содержание гепарина мало. Учитывая также, что для активации прохимазы in vitro требуется большой избыток DPP 1 [125, 130], можно предположить существование альтернативного механизма активации прохимаз с участием других дипептидилпептидаз, содержащихся в секреторных гранулах.
2.6. Субстратная специфичность химаз.
2.6.1. Синтетические субстраты.
Субстратная специфичность химаз человека, собаки, крысы (гМСР-1, гМСР-2) была исследована с использованием п-нитроанилидов пептидов [57, 131-133] и ряда тиобензиловых эфиров пептидов [132, 134, 135].
Исследованные ферменты проявляли наибольшую активность в растворах с
концентрацией солей, превышающей физиологические значения [55, 132].