Изучение фолдинга и конформационных изменений продукта гена 9 бактериофага Т4 с помощью моноклональных антител

• Автор: Жемаева, Любовь Вячеславовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 115 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений
Глава I. Введение
1.1. Актуальность проблемы
1.2. Цель и задачи работы
1.3. Научная новизна
Глава II. Обзор литературы
II. 1. Основные закономерности фолдинга
П.2. Домен как условная единица третичной организации белков
11.3. Две гипотезы механизма сворачивания полипептидной цепи
11.3.1. Гипотеза нуклеации и роста
11.3.2. Сворачивание с образованием кинетических интермедиатов
11.4. Молекулярные шапероны
11.4.1. DnaK/DnaJ система
П.4.2. GroEL/GroES система
П.4.3. Молекулярные шапероны в морфогенезе бактериофага Т
II. 5. Применение различных физико-химических методов для изучения
структуры и фолдинга белков
11.5.1. Адсорбционная спектроскопия
11.5.2. Инфракрасная спектроскопия
П.5.3. Круговой дихроизм (КД)
П.5.4. ‘Н-^С- и 15Т4-ЯМР- спектроскопия
П.5.5. ЭПР-спектроскопия
11.5.6. Флуоресцентная спектроскопия
11.5.7. Хроматография
П.5.8. Рентгеноструктурная кристаллография и малоугловое рассеяние
рентгеновского излучения
П.6. Иммунохимические методы исследования структурной организации
белков
П.6.1. Радиоиммунологический анализ
11.6.2. Иммуноферментный анализ (ИФА)
11.6.3. Электрофоретический перенос в сочетании с иммуноферментным

анализом.
Использование моноклональных антител в иммуноанализе
Белки бактериофагов как модельная система для изучения
структуры и фолдинга белков
Бактериофаг Т
Продукт гена 9 бактериофага Т
Материалы и методы
Материалы
Иммунизация животных
Получение моноклональных антител
Определение подкласса МКА
Получение препаративных количеств МКА
Очистка МКА из асцитной жидкости
Иммуноферментный анализ
Непрямой ИФА с сорбцией антигена на твердую фазу
Конкурентный ИФА
Определение константы диссоциации комплекса антиген -
антитело
Иммуноблоттинг
Штаммы бактериальных культур
Среды для выращивания бактерий и бактериофагов
Приготовление компетентных клеток E. coli
Трансформация компетентных клеток E. coli плазмидной ДНК
Экспрессия генов в клетках E. coli BL21(DE3)
Приготовление лизатов клеток Ж coli BL21(DE3)
Выращивание и очистка бактериофагов
Электрофорез белков в полиакриламидном геле
Выделение и очистка белков
Определение концентрации белка
Центрифугирование клеточных экстрактов в градиенте сахарозы
Результаты исследований
Получение и характеристика моноклональных антител
Взаимодействие антител с нативной и денатурированной

формами пг
IV.3, Исследование связывания МКА с мономерной и тримерной
формами пг
IV.4. Анализ структурных изменений у мутантов пг9, выявляемых
с помощью МКА
IV.4.1. Структурные и конформационные изменения, выявляемые у мутантных белков с делециями и точечными заменами
в С-концевой области пг
ГУ.4.2. Конформационные изменения, выявляемые у мутантных белков с делециями и точечными заменами в М-концевой области пг
IV.4.3. Конформационные изменения, выявляемые у точечных
мутантов 9*(174) и 9*(171, 174)
ГУ.5. Исследование взаимодействия МКА с базальной пластинкой
фагаТ
Глава V. Обсуждение результатов
V. 1. Роль отдельных аминокислотных остатков С-концевого
домена в олигомеризации тримера пг
.2. Конформационные изменения, выявляемые у точечных
мутантов 9*(174) и 9*(171, 174)
У.З. Делеции М-концевой последовательности и точечные мутации в суперспирали сойеб-сой приводят к нарушению правильного
фолдинга пг
У.4. Взаимодействие МКА с пг9 в составе базальной пластинки
бактериофага Т
Выводы
Список литературы

антитела. В этих случаях для образования преципитатов приходится использовать белок А или антииммуноглобулин. Кроме того, иммунопреципитация часто проводится в присутствии детергента (для предотвращения неспецифических реакций), что может изменить структуру эпитопа, а так как антитела чувствительны именно к конформационным особенностям анализируемого эпитопа, они не будут вступать с ним во взаимодействие [145]. Еще один фактор, который нужно учитывать при работе с МКА, - это лабильность самих МКА, которые могут потерять активность при сорбции на пластик или при введение ферментативной метки, что делает их непригодными для дальнейшего использования [146]. И, наконец, узкая специфичность МКА не является абсолютной. К настоящему времени широко известен феномен полиспецифичности некоторых МКА, которые могут вступать в перекрестные реакции с другими антигенами, имеющими сходную с гомологичным антигеном (использованным для иммунизации) или совершенно отличную структуру. Так, МКА D1.3, полученное к лизоциму яйца курицы, в 1000 раз сильнее взаимодействовало с белком, содержащим одну аминокислотную замену по сравнению с лизоцимом дикого типа [146]. Другой пример полиспецифичности МКА демонстрирует работа Фризона с соавт. [147], обнаружившими, что из шести МКА, взаимодействовавших с вирусом мозаики резухи (Arabis mosaic virus), два МКА вступали в перекрестные реакции с другими представителями группы неповирусов. Полиспецифичность МКА объясняется некоторой конформационной лабильностью антиген-связывающих участков антител, а также тем, что при отборе гибридомных клонов не ставится задача получения антител, имеющих наибольшее структурное соответствие данному антигену.