Роль окисления глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в регуляции гликолиза и связывании ее с РНК

• Автор: Даньшина, Полина Валерьевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 121 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. И-ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-З-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗА..
1.2. АЦИЛФОСФАТАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ
ГЛИЦЕРАЛЪДЕГИД-З-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ: ИНДУКЦИЯ ПЕРЕКИСЬЮ ВОДОРОДА И РЕГУЛЯЦИЯ ТИОЛАМИ
1.3. РОЛЬ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-З-ФОСФАТ
ДЕГИДРОГЕНАЗЫ В МЕТАБОЛИЗМЕ ЭРИТРОЦИТОВ
1.4. НЕГЛИКОЛИТИЧЕСКИЕ АКТИВНОСТИ
ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-З-ФОСФАТ ДЕГИДРОГЕНАЗЫ И РЕГУЛЯЦИЯ КЛЕТОЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА
1.4.1. Связывание ГАФД с РНК
1.4.2. Урацил-ДНК-гликозилазная активность ГАФД
1.5. ВЛИЯНИЕ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА НА
КЛЕТКУ И УЧАСТИЕ ГАФД В ЭТИХ ПРОЦЕССАХ
1.6. АПОПТОЗ
1.7. ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-З-ФОСФАТ ДЕГИДРОГЕНАЗА И
НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ:
ВОЗМОЖНАЯ РОЛЬ БЕЛОК-БЕЛКОВЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. МАТЕРИАЛЫ
2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.2.1. Определение концентрации белка
2.2.2. Определение концентрации иммобилизованного белка
2.2.3. Определение концентрации 3-ФГА, ИАИ* и 1ЧАОН
2.2.4. Определение концентрации 3-фосфоглицерата
2.2.5. Определение концентрации 2,3-дифосфоглицерата
2.2.6. Определение дегидрогеназной активности ГАФД
2.2.7. Определение ацилфоефатазной активности ГАФД
2.2.8. Определение активности 3-фосфоглицераткиназы
2.2.9. Определение фосфатазной активности
фосфоглицератмутазы
2.2.10. Определение мутазной активности
фосфоглицератмутазы
2.2.11. Определение активности ГАФД, иммобилизованной на
сефарозе
2.2.12. Электрофорез белков и РНК в полиакриламидном геле
2.2.13. Выделение 3-фосфоглицераткиназы
фосфоглицератмутазы, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и енолазы из мышц кролика
2.2.14. Дальнейшая очистка 3-фосфоглицератмутазы
2.2.15. Дальнейшая очистка 3-фосфоглицераткиназы и енолазы..
2.2.16. Дальнейшая очистка глицеральдегид
фосфатдегидрогеназы
2.2.17. Иммобилизация белков
2.2.18. Определение количества ковалентно связанных с
сефарозой субъединиц олигомерного белка ГАФД
2.2.19. Приготовление гемолизата эритроцитов
2.2.20. Получение цитоплазматической фракции ферментов из
мышц крысы и смеси очищенных гликолитических ферментов
2.2.21. Определение концентрации лактата
2.2.22. Измерение содержания АТР
2.2.23. Выделение суммарной транспортной РНК из
Saccharomyces cerevisiae

2.2.24. Включение [у32Р] в составе [у32Р] АТР в тРНК
2.2.25. Связывание РНК и ГАФД на нитроцеллюлозных
фильтрах
2.2.26. Титрование апофермента окисленной и восстановленной
ГАФД коферментами NAD+и NADH
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. РОЛЬ «МЯГКОГО» ОКИСЛЕНИЯ ГАФД В
РЕГУЛЯЦИИ ГЛИКОЛИЗА
3.1.1. Влияние окисления ГАФД перекисью водорода на
гликолиз
3.1.2. Влияние перекиси водорода на гликолиз при различных
концентрациях ADP
3.1.3. Влияние окисления ГАФД на накопление АТР
3.1.4. Влияние наличия АТР и отсутствия ADP на протекание
гликолиза
3.1.5. Влияние H202 на различные участки гликолиза
3.2. ВЛИЯНИЕ ИНДУКЦИИ АЦИЛФОСФАТАЗНОЙ
АКТИВНОСТИ ГАФД НА СОДЕРЖАНИЕ 2,3-ДИФОСФОГЛИЦЕРАТА И 3-ФОСФОГЛИЦЕРАТА В ЭРИТРОЦИТАХ
3.3. ВЛИЯНИЕ Н202 НА СВЯЗЫВАНИЕ ГАФД С
НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ
3.3.1. Влияние связывания Г АФД с РНК на олигомерность
фермента
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу. Трансфекция гранулярным клеткам мозга антисмысловой последовательностью глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы приводила к ингибированию программируемой клеточной смерти. При добавлении смысловых последовательностей эффекта не наблюдалось[Кпп et al., 1999]..
Участие глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в апоптозе связано с ее транслокацией в ядро [Sawa et al., 1997, Saunders et al., 1997, Ishitani et al., 1998, Berry, Boulton, 2000]. Более того, ингибирование апоптоза антисмысловой последовательностью глицеральдегид
фосфатдегидрогеназы препятствовало накоплению ядерной
глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Энзимологический анализ показал, что перемещение глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в ядро сопровождается утратой дегидрогеназной активности. Инкубация нейронов NG108-15 с 10 мкМ нитропруссида натрия в течение 24 часов приводила к конденсации ДНК и образованию апоптозных тел [Nomura et al., 1996]. В одной из работ появилось сообщение, что апоптоз в нервных клетках замедляется при применении препарата от слабоумия [Ishitani et al., 1998]. Существенно, что предложенный препарат подавляет экспрессию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.
На ряде клеток показано, что в начальных стадиях апоптоза увеличивается уровень ГАФД в клетке, причем в ядре клеток ГАФД исходно или отсутствует или находится в форме незначительных вкраплений- телец (например, PML телец (promyelocytic leukemia)), а основная масса фермента локализуется на периферии клетки в цитоплазме в виде кольцеобразных структур. Транслокация ГАФД в ядро предшествует клеточной смерти и является специфичной, ибо другие дегидрогеназы (лактатдегидрогеназа, пируваткиназа) в ядре не обнаруживаются. В клетках обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами ГАФД сохраняла свою цитозольную локализацию [Sawa et al., 1997]. Согласно литературным данным белки с массой до