Разработка подхода к генотерапии опухолей с помощью гена цитохрома человека CYP450 2В6

• Автор: Коломейчук, Сергей Николаевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 115 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
Содержание
Список сокращений
Введение
1. Обзор литературы: «Генная терапия онкологических заболеваний»
1.1. Что такое генная терапия ?
1.2 Направления генной терапии
1.3.Векторы для генной терапии
1.3.1. Невирусные системы доставки
1.3.1.1 Микроинъекдия ДНК
1.3.1.2. Трансфекция «голой ДНК»
1.3.1.3. Катионные липосомы
1.3.1.4. Катионные полимеры
1.3.2 Вирусные системы доставки
1.3.2.1.Аденовирусные векторы .
1.3.2.2.Ретровирусные векторы
1.3.2.3. Аденоассоциированные вирусы
1.4. Выбор систем доставки ДНК для генотерапии опухолей
1.5. Улучшение эффективности векторов
1.6. Генная терапия ненаследственных заболеваний
1.6.1. Рибозимы
1.6.2. Антисмысловые олигонуклеотиды
1.6.3. «Опухолевые» вакцины
1.6.4. Введение генов-супрессоров опухолевого роста
1.6.5. Введение генов «суицида»
1.6.6.Усиление цитотоксического эффекта генов «суицида» 57 1.7. Последние достижения генной терапии в клинике и будущие перспективы

2. Материалы и методы
2.1. Квалификация реактивов
2.2 Среды и антибиотики
2.3 Генотип использованных штаммов Е. coli
2.4 Методики клонирования
2.5 Индукция экспрессии CYP 2В6 в клетках E.coli.
2.6 Исследование СО-восстановленных спектров CYP
450 2В6 и определение содержания CYP2B6 в мембранной фракции клеток E.coli.
2.7 Характеристика комплексов ДНК-катионные
липосомы методом атомно-силовой микроскопии.
2.8 Определение токсичности катионных липидов
2.9 Определение токсичности катионных липосом in
vitro.
2.10 Трансфекция эукариотических клеток
репортерными генами и оценка эффективности трансфекции.
2.11 Выделение плазмидной ДНК для трансфекции.
2.12 Трансфекция эукариотических клеток
комплексами катионные липосомы - ДНК
цитохрома CYP 450 2В6.
2.13 Исследование чувствительности клеток к
циклофосфамиду.
3 Результаты исследований
3.1 Получение генетической конструкции,
экспрессирующей ген цитохрома CYP2B6.
3.1.1 Получение кДНК цитохрома Р450 2В6 из
рекомбинантной плазмиды
3.1.2.Получение промежуточной конструкции

риС9/Двтаї СУР 2В
3.1. Неполное расщепление плазмиды риС9/Д8та
3 СУР 2В6 рестриктазой ЕсоК с последующим гидролизом полученного продукта по сайту 8та
3.1.4.Клонирование гена цитохрома СУР2В6 в
экспрессионном эукариотическом векторе рсПИА
3.1. (+).
3.1.5.Экспрессия цитохрома СУР2В6 в бактериальных клетках.
3.2 Тестирование катионных липидов на цитотоксичность
3.3 Получение катионных липосом и оценка их цитотоксичности.
3.4 Характеристика комплексов ДНК-липосомы
3.5 Трансфекция клеток 293 геном цитохрома человека СУР 2В6.
3.6 Заключение
4 Выводы
5 Благодарности
6 Список литературы
Таблица 3. Некоторые клеточно-специфические промоторы
[44].
Г ен Клеточная специфичность Ссылки
AFP (а-фетопротеин) гепатома Kaneko, 1995 [66], Kanai, 1996 [67]
СЕА (карциноэмбриональны й антиген) рак легких, рак желудка Osaki, 1995 [6В], Tanaka, 1996 [69], Lan [70]
ЕгЬВ2 (белок ретровируса эритробластоза птиц) рак молочной железы, рак поджелудочной железы Harris, 1994 [71]
DF3/MUC1 (муциноподобный гликопротеин) рак молочной железы Chen, 1995 [72]
Фактор фон Виллебранда эндотелий Aird, 1995 [73], Ozaki, 1996 [74]
Тирозиназа меланома Vile, 1993 [75]
PSA (простатспецифический антиген) простата Lee, 1996 [76], Lee, 2002 [77]
1.5. Генотерапия ненаследственных заболеваний.
Как упоминалось выше, генотерапевтические протоколы, связанные с онкологическими заболеваниями, составляют львиную долю от их общего числа. В генотерапии злокачественных