Новый модифицированный орто-путь у Rhodococcus оpacus ICP, растущего на 2-хлорфеноле: энзиматические и генетические аспекты

• Автор: Моисеева, Ольга Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 134 с. : ил

Список сокращений
Обзор литературы
Глава 1. Энзиматические и генетические аспекты превращения фенолов и хлорфенолов бактериями
1.1. Фенолы и хлорфенолы - приоритетные поллютанты окружающей среды
1.2. Бактерии рода НИос1ососсих - эффективные деструкторы поллютантов
1.3. Основные пути превращения фенолов и хлорфенолов микроорганизмами
1.3.1. Мета-путь расщепления катехола
1.3.2. Классический и модифицированный орто-пути расщепления катехолов
1.4. Генетика биодеградативных путей катехола и хлоркатехолов
1.4.1. Структура генных кластеров катаболизма катехола и 4-хлоркатехола у /?йой?ососсга ораст 1СР
1.4.2. Сравнение с биодеградативными катехольными и хлоркатехольными оперонами других протеобактерий
1.4.3. Регуляция катехольного и хлоркатехольного оперонов
белками - активаторами
Экспериментальная часть
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Реактивы
2.2. Штаммы, использованные в работе
2.3. Культивирование штаммов
2.4. Выделение ферментов и методы их исследования
2.4.1. Аналитические методы
2.4.2. Получение бесклеточных экстрактов и определение концентрации белка
2.4.3. Определение активности ферментов
2.4.4. Очистка ферментов
2.4.4.1. Очистка 3-хлоркатехол 1,2-диоксигеназы
2.4.4.2. Очистка 2-хлормуконагг циклоизомеразы
2.4.4.3. Очистка 5-хлормуконолактон изомеразы
2.4.4.4. Очистка диенлактон гидролазы
2.4.4.5. Очистка фенол гидроксилазы
2.4.5. Определение физико-химических свойств ферментов
2.4.5.1. Определение субъединичного и молекулярного веса ферментов
2.4.5.2. Определение pH- и температурных оптимумов ферментов
2.4.5.3. Влияние ЭДТА на активность диенлактон гидролазы
2.4.6. Определение кинетических характеристик ферментов
2.5. Клонирование и секвенирование генов 3-хлоркагехольной ветви модифицированного орто-пути
2.5.1. Получение, выделение и секвенирование пептидов 3-хлоркатехол
1,2-диоксигеназы
2.5.2. Выделение хромосомной и плазмидных ДНК, приготовление Т-вектора и выделение фрагментов ДНК
2.5.3. Амплификация фрагмента 3-хлоркатехол 1,2-диоксигеназного гена
2.5.4. Приготовление компетентных клеток Е.соИ ОН5а и их трансформация
2.5.5. Блотгинги, гибридизации и клонирование
2.5.6. Сиквенс клонированной ДНК и его анализ
Глава 3. Результаты
3.1. Адаптация и особенности роста /?. ораст 1СР на 2- и 3-хлорфенолах и 3-хлорбензоате
3.2. Пути разложения 2- и 3-хлорфенолов и 3-хлорбензоата Я ораст 1СР
3.3. Ферменты 3-хлоркатехольной ветви модифицированного орто-пути разложения 2-хлорфенола Л ораст 1СР
3.3.1. З-Хлоркатехол 1,2-диоксигеназа
3.3.1.1. Очистка фермента
3.3.1.2. Температурный и рН-оптимумы
3.3.1.3. Кинетические константы фермента
3.3.2. 2-Хлормуконат циклоизомераза
3.3.2.1. Очистка фермента
3.3.2.2. Температурный и рН-опгимумы
3.3.2.3. Превращение 2-хлор-гщсцмс-муконата хлормуконат циклоизомеразой
3.3.2.4. Кинетические константы фермента
3.3.3. 5-Хлормуконолактон изомераза
3.3.3.1. Очистка фермента
3.3.3.2. Превращение 5-хлормуконолактона 5-хлормуконолактон изомеразой
3.3.4. Диенлактон гидролаза
3.3.4.1. Очистка фермента
3.3.4.2. Температурный и рН-оптимумы
3.3.4.3. Кинетические константы фермента
3.3.4.4. Влияние ЭДТА на активность диенлактон гидролазы
3.4. Применение метода ,9Р-ЛМР при исследовании функции и субстратной специфичности ферментов
3.4.1. Очистка фенол гидроксилазы из '/псЫщюгоп стане ит
3.4.2. Получение фторзамещенных катехолов
3.4.3. Субстратная специфичность 3-хлоркатехол 1,2-диоксигеназы
3.4.4. Субстратная специфичность 2-хлормуконат циклоизомеразы
3.4.5. Превращение 5-фтормуконолактона 5-хлормуконолактон изомеразой
3.5. Клонирование и секвенирование генов 3-хлоркатехольной ветви модифицированного орто-пута
3.5.1. Конструирование праймеров для амплификации фрагмента гена
3-хлоркатехол 1,2-диоксигеназы
3.5.2. Амплификация и секвенирование фрагмента хлоркатехол
1,2-диоксигеназного гена
3.5.3. Получение клона А’. соИ ОН5а с плазмидой, несущей фрагмент хромосомной ДНК Л ораст 1СР, кодирующий фрагмент хлоркатехол 1,2-диоксигеназного
гена
3.5.4. Картирование и определение нуклеотидной последовательности вставки рЯОР1
Обсуждение результатов
Выводы
Список литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
FAD - флавинадениндинуклеотид
NAD1 - никотинамидадениндинуклеогид, окисленный
NADH - никотинамидадениндинуклеотид, восстановленный
NADP+ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат, окисленный
NADPH - никотинамидадениндинуклеотидфосфат, восстановленный
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
Трис - трис(гидроксиметил)аминометан
БисТрис - бис(2-гидроксиэтил)иминотрис(гидроксиметил)метан
SDS - додецилсульфат натрия
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ПК 2,3-ДО - катехол 2,3-диоксигеназа
ПК 1,2-ДО - катехол 1,2-диоксигеназа
ХПК 1,2-ДО - хлоркатехол 1,2-диоксигеназа
ХМЦИ - хлормуконат циклоизомераза
МЦИ - муконат циклоизомераза
ДЛГ - диенлактон гидролаза
ХМЛИ - хлормуконолактон изомераза
РЕГ - регуляторный белок
Lys - лизин
Ser - серии
Cys - цистеин
His - гистидин
Glu - глутамат
Asp - аспартат
Asn - аспарагин
Arg - аргинин
Leu - лейцин
3-ХПК - 3-хлоркатехол
4-ХПК - 4-хлоркатехол
3-МПК - 3-метилкатехол
4-МГ1К - 4-мегилкатехол

зависимости от концентрации компонентов. Первоначальный объем каждого образца

составлял 1,71 мл, включая 100 мкл Н20 и 10 мкл 8,4 мМ 4-фторбензоата, используемого в качестве внутреннего стандарта.
2.4.2. Получение бесклеточных экстрактов и определение концентрации белка
Для приготовления бесклеточных экстрактов биомассу размораживали при комнатной температуре, ресуспендировали в небольшом количестве 50 мМ Трис/НС1 буфера, pH 7,4, содержащего 0,1 мМ дитиотреитола и разрушали на ИБФМ-прессе (рабочее давление в дезинтеграционной камере 3500 кг/см3, размер экструзионной щели 350 мкм). После добавления ДНКазы разрушенную биомассу выдерживали в течение 5-15 мин при комнатной температуре и центрифугировали при 15000-18000 g в течение 30-40 мин. Осадок промывали и повторно центрифугировали при тех же условиях. Полученный в обоих случаях супернатант объединяли и центрифугировали при 18000 g в течение 60 мин. Полученный в итоге бесклеточный экстракт использовали для очистки ферментов.
Концентрацию белка определяли по модифицированному методу Брэдфорд с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта (Bradford, 1976).

2.4.3. Определение активности ферментов
Определение активностей ферментов проводили спектрофотометрически на спектрофотометрах Shimadzu UV-160 и Shimadzu UV-2501PC в кварцевой кювете с длиной оптического пути 10 мм при 25°С.
Активность 3-хлоркатехол 1,2-диоксигеназы определяли по описанному ранее методу (Dorn and Knackmuss, 1978а). Реакционная смесь содержала: 50 мМ Трис/НС1, pH
7,4, 0,25 мМ катехола или замещенных катехолов, 1,3 мМ ЭДГА и фермент. Реакцию начинали добавлением фермента. Активность фермента рассчитывали по скорости образования продуктов при 260 нм, используя при расчетах коэффициенты молярной экстинкции (Dorn and Knackmuss, 1978b): 16,800 IVT’cm-1 для катехола; 17,100 М^см'1 для 3-хлоркатехола; 12,400 IVT'cm'1 для 4-хлоркатехола; 12,000 М‘'см'’ для 3,5-дихлоркатехола; 18,000 IVr’cM'1 для 3-метилкатехола; 13,900 М 'см'1 для 4-метилкатехола.
Активность 2-хлормуконат циклоизомеразы определяли по описанному ранее методу (Solyanikova et а!., 1995). Реакционная смесь содержала: 50 мМ Трис/НС1, pH 7,2, 2 мМ МпСЬ, 0,1 мМ субстрата и фермент. Реакцию начинали добавлением фермента. Активность фермента рассчитывали по скорости исчезновения субстрата при 260 нм,