Молекулярный анализ ГФИ-дефицитного клонального гематопоэза в пароксизмальной ночной гемоглобинурии

• Автор: Лякишева, Анна Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Ганновер
• Количество страниц: 110 с. : ил

Научные руководители:
Проф. Др. Шмидт Проф. Др. Мюллер
День присуждения степени:
5 февраля 2002
1. Обзор литературы
1.1. Пароксизмальная ночная гемоглобинурия: Клиническая картина
1.2. Клеточный фенотип в ПНГ
1.3. Комплемент-опосредованный гемолиз
1.4. Биосинтез ГФИ-якоря и РЮ-А ген
1.5. ПНГ как результат клональной экспансии ГФИ-дефицитных клеток
1.5.1. Стволовые клетки в ПНГ обладают внутренним ростовым преимуществом, которое не обусловлено мутацией гена Р1С-А
1.5.2. Гипотеза клеточной селекции и "иммунного побега" в ПНГ
1.5.3. Устойчивость к апоптозу
1.5.4. Возникнование дополнительных изменений в репертуаре клеточной активации неоходимо для развиия ПНГ
2. Материалы и Методы
2.1. Материалы
2.1.1. Химические вещества и реагенты
2.1.2. Буферные и др растворы
2.1.3. Бактериальные штаммы, векторы для клонирования и плазмиды
2.1.4. Олигонуклеотиды и праймеры
2.1.5. Линии эукариотических клеток
2.1.6. Ферменты
2.1.7. Антитела
2.1.8. Другие материалы
2.1.9. Наборы
2.1.10. Лабораторное оборудование
2.2. Методы
2.2.1. Модификация ДНК
2.2.2. Выделение плазмидной ДНК
2.2.3. Выделение РНК
2.2.4. Выделение геномной ДНК
2.2.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

2.2.6. ОТ-ПЦР
2.2.7. Выделение и очистка ПЦР продуктов и ДНК фрагментов из агарозного геля
2.2.8. Определение концентрации нуклеиновых кислот
2.2.9. Осаждение нуклеиновых кислот
2.2.10. Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот
2.2.11. Щелочной блоттинг РНК
2.2.12. Нозерн блот анализ
2.2.13. Клонирование
2.2.14. Трансформация E. coli
2.2.15. ДНК секвенирование
2.2.16. Культивирование эукариотических клеток
2.2.17. Получение Т-клеточных линий из пациентов с ПРІГ
2.2.18. Выделение мононуклеарных клеток и гранулоцитов
2.2.19. ПЦР-основаный фингерпринтинг РНК
2.2.20. Гибридизация с панелью кДНК
2.2.21.Анализ на проточном цитофлуориметре (FACS)
2.2.22. In vitro стимуляция гранулоцитов
2.2.23. Флуоресцентный in situ гибридизационный анализ (FISH)
3. Результаты
3.1. Идентификация генов, дифференциально экспрессирующихся в ГФИ-положительных и ГФИ-отрицательных клетках при ПНГ
3.1.1. Получение ГФИ-положительных и ГФИ-отрицательных ПНГ клонов
3.1.2. Гибризация с Atlas кДНК панелью экспрессии генов
3.1.3. PCR-основанный дифференциальный скрининг - РНК фингерпринтинг
3.1.4. Гены с модулированной экспрессией в ГФИ-дефицитных ГІНГ клетках
3.2. EGR-1 и TAXREB107: изучение экспрессии
3.2.1. Пациенты, исследованные в этой работе
3.2.2. Получение EGR-1 и ß-актин проб
3.2.3. Экспрессия EGR-1 в ПНГ гранулоцитах
3.2.4. Экспрессия в гранулоцитах пациентов с другими гематологическими заболеваниями
3.2.5. Получение ТАХЕЕВ107-специфических проб
3.2.6. Экспрессия TAXREB107 в гранулоцитах ПНГ пациентов и пациентов с родственными гематологическими заболеваниями
3.3. Оверэкспрессия Egr-1 и измененный уровень цитокинов
3.4. EGR-1: анализ up-stream транскрипционных факторов
3.4.1. Пробы, использованные в Northern блот анализе

Результаты
3. Результаты
В этой работе были идентифицированы несколько генов, дифференциально экспрессированных в ГФИ-положителъных и ГФИ-отрицательных клетках ПНГ пациентов. Далее экспрессия двух генов была исследована, подтверждена и охарактеризована в ПНГ.
3.1. Идентификация генов, дифференциально экспрессирующихся в ГФИ-положительных и ГФИ-отрицательных клетках при ПНГ
Чтобы идентифицировать дифференциально экспрессирующиеся гены, ответственные за ростовое преимущество и клональную экспансию ГФИ-дефицитного клона в ПНГ, мы использовали комбинацию двух различных подходов: РНК-фингерпринтинг технику и гибридизацию с коммерчески доступной "Atlas array" панелью кДНК. Техника гибридизации с кДНК паиелыо позволила нам сравнивать экспрессию сотен предварительно охарактеризованных генов одновременно. В свою очередь, PCR-основанный РНК-фингерпринтинг является мощным методом, позволяющим проанализировать экспрессию не только известных и охарактеризованных генов, но также и новых.
3.1.1. Получение ГФИ-положителъных и ТФИ-отрицательных ПНГ клонов
В качестве модели ГФИ-положительного и ГФИ-отрицательного ПНГ клонов мы использовали CD48+ и CD48- Т-лимфоцитарпые клеточные линии из одного и того же ПНГ пациента (А.П.), полученные как описано в Methods. Важно, что эти линии клеток были получены без какого-либо шага иммортализации (вирусное преобразование и т.д.), что