Участие фосфатидилэтаноламина в биогенезе щелочной фосфатазы у Escherichia coli

• Автор: Головастов, Виктор Викторович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 126 с. : ил

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АФЛ - анионные фосфолипиды
KJI - кардиолипин
ЛПС - липополисахарид
НСД - нуклеотид-связывающий домен
СП - сигнальный пептид
ТХУ - трихлоруксусная кислота
ФК - фосфатидная кислота
ФГ - фосфатидилглицерин
ФЭА - фосфатидилэтаноламин
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
A (Ala) - аланин
Ds-Na - додецилсульфат натрия
Е (Glu) - глутаминовая кислота
К (Lys) - лизин
PhoA - зрелая форма щелочной фосфатазы npePhoA - предшественник щелочной фосфатазы Р; - ортофосфат

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА 1. СЕКРЕЦИЯ БЕЖОВ У БАКТЕРИЙ И РОЛЬ ФОСФОЛИПИДОВ
В ЭТОМ ПРОЦЕССЕ
1Л. Современные представления о секреции белков
1Л Л. Топогенные последовательности секретируемых белков и их
роль в секреции
1Л .2. Белковые компоненты секреторного аппарата бактерий
1Л .3. Возможный механизм участия белковых компонентов
секреторного аппарата в секреции
1.2. Участие фосфолипидов в секреции белков
1.2.1. Особенности структуры и обмена фосфолипидов
1.2.2. Взаимосвязь между секрецией белков и составом, обменом
и физико-химическим состоянием фосфолипидов
1.2.3. Доказательства участия фосфолипидов в секреции белков
с помощью фосфолипидных мутантов
1.2.4. Взаимодействие фосфолипидов с сигнальными пептидами
1.2.5. Влияние фосфолипидов на функционирование белковых компонентов секреторного аппарата
1.2.6. Влияние фосфолипидов на сборку мембранных белков
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды
2.2. Среды и условия культивирования
2.3. Элиминация плазмиды pDD72 из клеток E. coli
2.4. Трансформация клеток E. coli плазмидной ДНК
2.5. Выделение плазмидной ДНК
2.6. Анализ секреции щелочной фосфатазы

2.7. Анализ динамики превращения импульсно меченого предшественника щелочной фосфатазы в зрелую форму
2.8. Анализ изоформ щелочной фосфатазы
2.9. Выделение периплазмы
2.10. Анализ синтеза белка и РНК
2.11. Иммуноферментный анализ щелочной фосфатазы
2.12. Анализ фосфолипидного состава мембран
2.12.1. Экстракция липидов
2.12.2. Тонкослойная хроматография
2.12.3. Определение липидного фосфора
2.13. Электрофорез белков
2.14. Определение активности щелочной фосфатазы
2.15. Определение белка
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 3. УЧАСТИЕ ФОСФАТИДИЛЭТАНОЛАМИНА В БИОГЕНЕЗЕ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ
3.1. Фосфолипидный состав клеток Е. coli AD93 контролируется условиями их выращивания
3.2. Фосфатидилэтаноламин необходим для транслокации щелочной фосфатазы через цитоплазматическую мембрану
3.3. Секреция щелочной фосфатазы в отсутствие фосфатидилэтаноламина коррелирует с содержанием кардиолипина
3.4. Изменение фосфолипидного состава мембран влияет на посттранслокационную модификацию щелочной фосфатазы
3.5. Биосинтез щелочной фосфатазы подавляется в отсутствие фосфатидилэтаноламина
ГЛАВА 4. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ФОСФОЛИПИДОВ С ТОПОГЕННЫМИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯМИ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ В ПРОЦЕССЕ ЕЕ СЕКРЕЦИИ

способствовала последующим исследованиям роли фосфолипидов в секреции.
1.2.3. Доказательства участия фосфолипидов в секреции белков с помощью фосфолипидных мутантов
Создание мутантных штаммов E. coli, дефектных по биосинтезу специфических классов фосфолипидов, открыло новые возможности для изучения роли фосфолипидов в секреции белков (Heacock, Dowhan, 1987; DeChavigny et al., 1991; Küsters et al., 1991). Используя мутантный штамм E. coli, в котором снижено содержание анионных фосфолипидов - KJI и ФГ, Де Врие с соавторами показали замедление скорости транслокации предшественников белков внешней мембраны ОшрА и PhoE in vivo (de Vrije et al., 1988). При этом был редуцирован синтез белка PhoE, но не цитоплазматического белка хлорамфеникол-ацетилтрансферазы. В бесклеточной системе был проведен более детальный анализ влияния анионных фосфолипидов на транслокацию prePhoE. Транслокация в инвертированные мембранные везикулы тестировалась с помощью эндогенной лидерной пептидазы, включенной в везикулы, а также по устойчивости белка к экзогенно добавленной протеиназе. Было обнаружено, что транслокация prePhoE через мембраны везикул с недостатком анионных фосфолипидов in vitro снижалась в большей степени, чем in vivo. Для того чтобы различить влияние ФГ на транслокацию от влияния KJ1 был использован штамм, дефектный по синтезу кардиолипина. Как оказалось, транслокация prePhoE в этом штамме была такой же, как и в штамме с нормальным фосфолипидным составом, что свидетельствует о важности ФГ, но не KJ1, для этого мембранного процесса. Полученные результаты, однако, не исключают ту возможность, что даже минимальное содержание KJI (0,1% от общего содержания фосфолипидов) в мутантах по синтезу этого фосфолипида удовлетворяет специфическую потребность в нем для транслокации белка, или что КЛ и ФГ выполняют одинаковую роль в этом