Парагидроксибензоат гидроксилазы Rhodococcus: кинетические и спектральные свойства

• Автор: Жадан, Андрей Петрович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 98 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
1 ВВЕДЕНИЕ
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ПАРАГИДРОКСИБЕНЗОАТ-З-ГИДРОКСИЛАЗЫ -ПРЕДСТАВИТЕЛИ ФЛАВИНОВЫХ МОНООКСИГЕНАЗ
2Л Общая информация
2.2 и-Гидроксибензоат-З-гидроксилазы [КФ 1.14.13.2]
2.3 Функция ферментов
2.4 Основные каталитические свойства ПГБГ
2.5 Механизм реакции катализируемой и-гидроксибензоат-3-гидроксилазами
2.6 Восстановительная часть каталитического цикла
2.7 Окислительная часть каталитического цикла
2.8 Ингибирование
2.9 Изменение конформации флавина в ходе катализа
2.10 Структура и-гидроксибензоат-3-гидроксилаз
3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 Реактивы и материалы
3.2 Штаммы
3.3 Условия культивирования
3.4 Очистка ферментов
3.4.1 Очистка я-гидроксибензоат-3 -гидроксилаз
3.4.2 Очистка протокатехоат-3,4-диоксигеназ
3.5 Аналитические методы
3.5.1 Измерение активности ферментов
3.5.2 Определение стехиометрии реакции
3.5.3 Получение апофермента и определениие Кт?АТ)
3.5.4 Определение pH зависимой стабильности ферментов
3.5.5 Электрофорез и электроблоттинг
3.5.6 Аналитическая гель-фильтрация
3.5.7 Спектральные измерения
3.5.8 Определение коэффициента молярной экстинкции при 450 нм
3.5.9 Спектральные изменения при связывании субстрата
3.5.10 Определение спектров флуоресценции свободного фермента и фермент-
субстратных комплексов с ПГБ и его производными

3.5.11 Определение констант диссоциаций производных ПГБ с ферментом
3.5.12 Анализ продуктов методом ВЭЖХ
3.5.13 Анализ продуктов методом Б19-ЯМР
3.5.14 Расщепление ПГБГ трипсином
4 РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1 Выбор микроорганизмов
4.2 Выращивание биомассы для выделения ферментов
4.3 Выделение и-гидроксибензоат гидроксилаз
4.4 Выделение и свойства протокатехоат диоксигеназы из R. rhodnii
4.5 Молекулярная масса и гидродинамические свойства я-гидроксибензоат гидроксилаз
4.6 Стабильность я-гидроксибензоат гидроксилаз
4.7 Кинетические свойства я-гидроксибензоат гидроксилаз с естественными субстратами
4.8 Ингибирование ферментов
4.9 Спектры нативных ферментов
4.10 Выбор ферментов для дальнейшего изучения
4.11 Спектральные свойства ферментов и фермент-субстратных комплексов ПГБГ из Rhodococcus opacus 557 и Rhodococcus rhodnii
4.11.1 Спектры поглощения свободных ферментов
4.11.2 Спектры поглощения при связывании естественного субстрата (ПГБ) с ферментами
4.11.3 Изменения спектров поглощения при связывании замещенных ПГБ
4.11.4 Зависимость конформации флавина в фермент-субстратном комплексе от pH..
4.11.5 Флуоресцентные свойства ферментов
4.11.6 Связывание замещенных парагидроксибензоатов ПГБГ из Rhodococcus opacus 557 и Rhodococcus rhodnii
4.12 Субстратная специфичность ПГБГ из Rhodococcus opacus 557 и Rhodococcus rhodnii
4.13 Региоспецифичность гидроксилирования замещенных ПГБ ферментами из Rhodococcus opacus 557 и Rhodococcus rhodnii
4.13.1 Региоспецифичность гидроксилирования дигидроксибензоатов
4.13.2 Региоспецифичность гидроксилирования монохлорзамещенных ПГБ
4.13.3 Региоспецифичность гидроксилирования монофторзамещенных ПГБ

4.13.4 Региоспецифичность гидроксияирования тетрафторпарагидроксибензоата.
4.14 Анализ ТЧ-концевых последовательностей ферментов
4.15 Действие трипсина на ПГБГ из Шо^соссиэ орасиь 557 и Шойососсю гкойпи
5 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
6 ВЫВОДЫ
7 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

соединений, а также в присутствии FAD, концентрированные растворы ферментов (>10 мг/мл) намного стабильнее. Наиболее эффективным стабилизатором является ДТТ. Более того, добавление значительного количества ДТТ (~ 5 мМ) к растворам ферментов, потерявшим до 30-40 % активности в результате хранения, приводило к восстановлению значительной ее части, что указывает на наличие легкодоступных и легко окисляемых аминокислотных остатков, таких, как цистеин. Кроме того, одним из наиболее эффективных методов регенерации ПГБГ является проведение ферментативной реакции с ПГБ и большим избытком NADH с последующей очисткой от продуктов реакции на гель-фильграционной колонке. Изучая стабильность ферментов как функцию pH, мы обнаружили интересную особенность: ПГБГ имели два пика в зависимости стабильности ферментов от pH - все ферменты имели более или менее выраженный пик в сильно щелочной области pH, причем фермент из Rhodococcus opacus 1G значительно более стабилен как раз в области второго пика, при pH 9-9,5 (Рисунок 11).
При инкубации ПГБГ из Rhodococcus при 50° и pH 7,2 инактивация ферментов происходила довольно быстро за исключением фермента из Rhodococcus rhodnii 135 (Таблица 5), стабильность которого сопоставима с ферментом из Pseudomonas jluorescens (van Berkel and Muller 1989). Наименее стабильным ферментом оказалась ПГБГ из Rhodococcus opacus 1G, это объясняется тем, что оптимум стабильности этого фермента лежал в районе pH 9, а не 7,2 (Рисунок 11). Субстрат значительно стабилизировал ферменты при тепловой денатурации (Таблица 5) - эффект наблюдаемый у всех ферментов подобного типа (Entsch and Ballou 1989; Fernandez et al. 1995; Fujii and Kaneda 1985; van Berkel and Muller 1989).
Таблица 5. Некоторые свойства ПГБГ из штаммов рода Rhodococcus
Штамм продуцент Молек. масса, кДа Время полуинактивации (мин) при 50°С и pH 7,2 ^271^442 kmax, нм
Нет ПГБ ПГБ добавлен
R. rhodochrous 172 -95 (2 x 45) 50
R. opacus 1G -95(2x51) 9 30 7 370;
Rhodococcus sp. 400 -95 (2 x 45) 37 65 6,2 371;
R. opacus 420 -95 (2x47,5) 15
R. rhodnii 135 -95 (2 x 48,5) 180 250 8,9 370,5;
R. opacus 557 -95 (2x46) 45 85 7,3 370,5;