Новые свойства углеводсвязывающих белков: лектина из мидии Crenomytilus grayanus и галектина-3 человека

• Автор: Фуртак, Вячеслав Анатольевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 144 с. : ил.

Список сокращений
* Благодарности
1. Обзор литературы. Галактозоспецифичные лектины как
активные вещества, узнающие различные углеводные структуры в гликоконъюгатах
1.1. Углеводные структуры, содержащие галактозу в гликонъюгатах
£ 1.2. Связывание различных гликоформ лектинами
1.3. Характеристика ОаШаШАс - специфичного лектина из мидии
СгепотуШш grayanus (СвЬ)
1.4. Муцины в аденокарциномах толстой кишки человека
1.5. Нейрональные Са!ЛЗа1ЫАс-содержащие гликонъюгаты как 35 маркеры в спинномозговых ганглиях крыс
1.6. Галектин-3 в межклеточном матриксе
1.6.1. Общая характеристика галектина-3 человека
1.6.2. Аффинность связывания галектином-3 различных 41 углеводных остатков
1.6.3. Рецепторы (лиганды) галектина-3 на клеточной поверхности 44 и в межклеточном пространстве
ф 1.6.4. Роль галектина-3 в органогенезе и ангиогенезе
1.6.5. Галектин-3 и эндоцитоз/экзоцитоз
1.6.6. Галектин-3 и клеточная адгезия
1.7. Заключение 5
2. Материалы и методы
2.1. Объекты исследования
$ 2.2. Реактивы и реагенты
2.3. Аналитические методы
2.3.1. Электрофорез белков в полиакриламидном геле

2.3.2. Вестерн-блоттинг
2.3.3. Определение концентрации белка
2.3.4. Гемагглютинационный тест активности лектинов
^ 2.4. Окрашивание гистологических препаратов по Шиффу и
альциановым синим
2.5. Окрашивание тканевых и клеточных препаратов лектинами
2.5.1. Приготовление гистологических препаратов
2.5.2. Получение конъюгата CGL с пероксидазой хрена
2.5.3. Окрашивание препаратов конъюгатами лектинов
ф 2.6. Получение рекомбинантного галектина-3
2.6.1. Клонирование белка
2.6.2. Экспрессия рекомбинантных белков
2.6.3. Аффинная хроматография белков на Ni-агарозе
2.6.4. Получение конъюгата белков с флюоресцентной меткой
2.6.5. Получение галектина-3 без гистидиновой (6 HisTag) метки
ф 2.7. Анализ эндоцитоза Pi-интегринов на флюоресцентном
сортировщике клеток (FACS)
2.8. Флюоресцентный анализ эндоцитоза галектина-3 , CGL и Рг 72 интегринов
2.9. Влияние гапектина-З и CGL на адгезивность клеток карциномы
молочной железы
♦ 3. Результаты и обсуждение
3.1. Морфологическая характеристика аденокарцином толстой 75 кишки человека
3.2. Рецепторы CGL в толстой, тонкой кишке человека и крысы
3.3. Гистопатология рецепторов CGL в опухолях толстой кишки 91 человека
^ 3.4. Рецепторы CGL в спинномозговых ганглиях крыс
3.5. Клонирование и очистка рекомбинантных белков

3.6. Эндоцитоз рринтегринов и галектина-3 клетками карциномы 112 молочной железы
3.7. Влияние экзогенного галектина-3 на микрофиламенты и
;ф распластывание клеток
3.8. Эндоцитоз СОЬ клетками карциномы молочной железы не 120 меняет их адгезивность
3.9. Модель регуляции клеточной адгезии галектином-3 и ССЬ
Выводы
Заключение
Список литературы

клеточные процессы, включая экзоцитоз и эндоцитоз. Существуют и другие мультифункциональные белки, напоминающие по своим свойствам галектин-3. Например, аннексиям, синтезированные на свободных рибосомах клеточной цитоплазмы, экскретируются из клетки без помощи сигнальных пептидов (Siever, Erickson, 1997). Подобно галектину-3, они также рассматриваются как мультифункциональные белки, чья роль в межклеточном матриксе точно неизвестна. Например, аннексин-5 является маркером апоптоза, т.к. он связывает фосфатидилсерин, который переносится из внутреннего слоя мембраны в наружный при апоптозе (Pepper et al., 1998). Таким образом, пока очевиден сам факт участия галектина-3 в эндоцитозе и его взаимодействие с другими молекулами, но неясен механизм этого взаимодействия.
Галектин-3 в силу отсутствия сигнального пептида, главным образом, цитоплазматический белок, и его внутриклеточное содержание намного превосходит концентрацию на клеточной поверхности или в межклеточном матриксе. Механизм, благодаря которому он транспортируется из клетки, неясен, и, скорее всего, это может быть новый путь экзоцитоза. Опухолевые клетки характеризуются особенно высокой скоростью секреции галектина-3. Поэтому этот тип секреции нельзя отнести к неклассическим механизмам (Sato et al., 1993; Hughes, 1999; Menon, Hughes, 1999).
1.6.6. Галектин-3 и клеточная адгезия
Взаимодействие клеток с межклеточным матриксом происходит в основном за счет интегринов клеточной поверхности (Hynes et al., 1987). Однако существуют белки клеточной поверхности, модулирующие их активность. В модели адгезии (Hughes, 2001) галектин-3 может связывать гликозилированный CD-98 на поверхности клетки, который, в свою очередь, инициирует образование кластеров интегринов на поверхности плазматической мембраны. В результате этого возрастает авидность связывания (Hughes, 2001). В ряде работ показано, что интегрины аїРі и CD-