Температурная зависимость кинетических характеристик ацетилхолинэстеразы в норме и при низких температурах тела

• Автор: Джафарова, Альбина Мехьядиновна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Махачкала
• Количество страниц: 128 с. : ил.

ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Распределение ацетилхолинэстеразы
1.2. Функции ацетилхолинэстеразы
1.3. Молекулярные формы ацетилхолинэстеразы
1.4. Структура ацетилхолинэстеразы
1.5. Механизм действия
1.6. Субстратная зависимость ацетилхолинэстеразы
1.7. Влияние ингибиторов на ацетилхолинэстеразу
1.8. Температурная зависимость активности ацетилхолинэстеразы
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объекты исследования
2.2. Постановка опытов
2.2.1. Способ достижения глубокой гипотермии у крыс
2.2.2. Способ вызывания зимней спячки у сусликов
2.3. Препаративные методы исследования
2.3.1. Выделение синаптических мембран
2.4. Диализ рекомбинантной ацетилхолинэстеразы мембран эритроцитов человека
2.4.1. Определение активности АХЭ
2.4.2. Определение кинетических характеристик АХЭ
2.5. Статистическая обработка эксперементальных данных
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Температурная зависимость кинетических характеристик АХЭ мембран синаптосом
3.1.1. Исследование температурной зависимости кинетических кинетитических характеристик ацетилхолинэстеразы мембран синаптосом коры головного мозга крыс
3.1.2. Влияние глицерина на кинетику АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга крыс
3.2. Температурная зависимость кинетических характеристик рекомбинантной АХЭ
3.2.1. Температурная зависимость кинетических характеристик рекомбинантной АХЭ мембран эритроцитов человека
3.2.2. Исследование температурной зависимости кинетических характеристик рекомбинантной ацетилхолинэстеразы мембран эритроцитов человека в
присутствии глицерина
3.3. Температурная зависимость кинетических характеристик АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга при гипотермических состояниях
3.3.1.Влияние гипотермии на температурную зависимость кинетических характеристик АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга крыс
3.3.2. Влияние зимней спячки на температурную зависимость кинетических
характеристик АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга сусликов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Актуальность проблемы. Ацетилхолинэстераза - это ключевой фермент холинэргической нейро-медиаторной передачи импульсов (Venturino et al., 2002). Холинэргические синапсы распределены по всему мозгу, в том числе и коре больших полушарий, и играют важную роль в регуляции активности мозга (Brzin et al., 1983).
Основная функция ацетилхолинэстеразы (АХЭ) заключается в гидролизе ацетилхолина, поступающего в синаптическую щель в ответ на приходящий в терминаль импульс, с образованием ацетата и холина (Taylor, Brown, 1999). Активность фермента непосредственно влияет на ход физиологического процесса, занимающего несколько миллисекунд (Куффлер, Николс, 1979). Интегрированность химической реакции в быстрый физиологический процесс определила кинетические особенности АХЭ: высокая специфичность, наличие двух мест связывания ацетилхолина и эффекта субстратного ингибирования (Mailender et al., 2000).
АХЭ - это эктофермент, который, в основном локализован на внешней стороне постсинаптической мембраны, рядом с холинорецептором, и прикреплен к мембране синапсов с помощью «якорной» субъединицы, в качестве которой выступает фосфатидилинозитол (Haas et al, 1996). Известно, что фос-фолипидный и жирнокислотный состав оказывают влияние на фазовоструктурное состояние мембраны, от которого зависисят активность и кинетические характеристики АХЭ (Frenkel et al., 1980; Bloi et al, 1974). Одним из факторов, определяющих фазово-структурное состояние мембран является и температура (Крепе, 1981). Вместе с тем неизвестно, как физико-химическое состояние подложки влияет на кинетические свойства АХЭ. Сравнительное исследование мембранносвязанного и солюбилизилированного фермента, возможно, позволит выяснить роль мембраны в функционировании АХЭ.
Установлено, что изменение температуры тела приводит к изменению электрической активности мозга (Deboer, 1998), основой которой является хо-линэргическая передача импульсов. Снижение температуры тела при искусстТаблица
Влияние глицерина на концентрационную зависимость АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга крыс при разных температурах инкубации (М+ш; п=5)
Условия опыта г, °с Концентрация АТХ, мМ
0,0156 0,0312 0,0625 0,125 0,25 0,5 1 2 4
Без глицерина 10 5,92 ±0,26 10,20 ±0,04 13,67 ±0,11 16,25 ±0,42 19,15 ±0,08 20,72 ±0,27 19,03 ±0,19 17,00 ±0,53 15,47 ±0,20 12,07 ±0,12
37 16,72 ±0,42 21,35 ±0,58 26,57 ±0,70 35,97 ±0,66 55,8 ±0,47 61,32 ±0,72 57,95 ±0,73 42,70 ±0,72 36,6 ±0,34 27,7 ±0,58
1% глицерин 10 4,74 ±0,17 9,04 ±0,32 12,54 ±0,45 16,72 ±0,48 20,54 ±0,21 22,08 ±0,22 20,48 ±0,30 18,00 ±0,21 15,12 ±0,24 12,76 ±0,69
37 12,84 ±0,58 17,90 ±0,33 23,1 ±0,51 32,34 ±0,43 49,78 ±0,85 58,34 ±0,22 58,08 ±0,36 49,42 ±0,48 39,12 ±0,50 29,7 ±0,5
2% глицерин 10 7,16 ±0,16 11,66 ±0,16 15,10 ±0,05 18,60 ±0,03 22,03 ±0,14 23,02 ±0,11 21,93 ±0,34 18,66 ±0,52 15,50 ±0,57 12,9 ±0,0
37 10,33 ±0,72 15,53 ±0,60 20,1 ±0,66 26,16 ±0,60 39,46 ±0,37 55,46 ±0,67 57,16 ±0,44 50,93 ±0,92 40,26 ±1,24 29,37 ±4,73