Регуляция экспрессии гена церулоплазмина в клетках молочной железы

• Автор: Гюлиханданова, Наталия Евгеньевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 136 с.

»► СПИСОК СОКРАЩЕНИИ ВВЕДЕНИЕ 4
ЧАСТЬ 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Структура молекулы ЦП И
1.2. Структура и экспрессия гена ЦП
1.3. Биосинтез ЦП, встраивание меди и посттрансляционные
1.4. модификации Тканеспецифические молекулярные формы ЦП и ЦП
1.4.1 подобные белки Тканеспецифические молекулярные формы ЦП
к ■■ 1.4:2. Мембраносвязанные формы ЦП
1.5. Изменения тканеспецифической активности гена ЦП в
1.5.1. онтогенезе Эмбриональный тип метаболизма меди у млекопитающих
1.5.2. Взрослый тип метаболизма меди
1.6. Роль ЦП молока как источника ионов меди для
*• 1.7. новорожденных Церулоплазмин как многофункциональный белок
1.8. Церулоплазмин - “moonlighting” белок
1.9. Потенциальные механизмы регуляции экспрессии генов,
1.9.1. кодирующих “moonlighting” белки Регуляция на уровне транскрипции
1.9.2. Альтернативная транскрипция
1.9.3. Альтернативный сплайсинг
1.9.4. Транс-сплайсинг
1.9.5. Альтернативное полиаденилирование
1.9.6. Регуляция на уровне трансляции
1.9.7. Альтернативные сайты инициации трансляции
Ч ЧАСТЬ 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы, использованные в работе
2.2. Методы, использованные в работе
2.2.1. Методы выделения препаратов белков и НК
2.2.2. Методы исследования НК
- 2.2.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2.2.4. Методы исследования белков
2.2.5. Клонирование фрагмента хромосомного гена ЦП крысы
2.2.6. Методы анализа взаимодействия ДНК и белков
2.2.7. Аналитические методы
ЧАСТЬ 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1.4. 3.2.

3.2.4. 3.3.

3.3

Содержание ЦП и меди в молоке человека и крыс в течение лактации
Изменение концентрации ЦП и ионов меди в грудном молоке в первые дни лактации
Содержание несвязанных с ЦП ионов меди в грудном молоке
Содержание ЦП и связанной с ним меди в молоке лабораторных крыс
Изменение активности гена ЦП у новорожденных крыс, вскармливаемых молочными смесями Экспрессия генов, участвующих в транспорте меди, в клетках молочной железы на разных стадиях ее развития Содержание мРНК-транскриптов генов ЦП, Ог1, АТФазы Менкеса и АТФазы Вильсона в молочной железе в разные периоды развития
Содержание иммунореактивных белков ЦП, АТФаз Вильсона и Менкеса во фракциях плазматических мембран молочной железы крысы во время беременности и лактации Сопоставление уровня ЦП-мРНК и СТШ-мРНК в клетках молочной железы с концентрацией ЦП и меди в молоке Исследование экспрессии генов метаболизма меди на культивируемых клетках молочной железы Выявление потенциальных регуляторных последовательностей в гене ЦП крысы и человека Поиск г/ис-элементов в 5'-регионе гена ЦП Экспериментальный анализ 5’-региона гена ЦП крысы Поиск потенциальных сайтов регуляции активности гена ЦП крысы во внутригенной области хромосомного гена Анализ 5’-региона гена ЦП человека
Сопоставление содержания ЦП в молоке с выявленными при анализе ПЦР-продуктов изменениями в структуре промоторного участка гена ЦП
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

66 69 71 76

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
5’- и З’-иТЯ 5’ и З’-нетранслируемая область
АТР7А АТФаза Менкеса
АТР7В АТФаза Вильсона
вРІ гликозилфосфатидилинозитол
ІРТС изопропил Р - О-тиогалактопиранозид
РВБ натрий фосфатный буфер
БОБ додецилсульфат натрия
ТЕМЕО N,N,14' ,И' -тетраметилэтилендиамин
а.о. аминокислотный остаток
ДТТ дитиотреитол
кДа килодальтон
м.м. молекулярная масса
мсм метаболическая система меди
НЦФ нитроцеллюлозный фильтр
ОТ-ПЦР полимеразная цепная реакция, сопряженная с обратной транскрипцией
п.н. пара нуклеотидов
ПААГ полиакриламидный гель
прсРНК полирибосомная ДНК
ПСА персульфат аммония
ПЦР полимеразная цепная реакция
т.п.н. тысяча пар нуклеотидов
ТФ транскрипционные факторы
ЦІІС центральная нервная система
ЦП церулоплазмин
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭПР электронно-парамагнитный резонанс
ЯФ ядерные факторы

ЧАСТЬ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы, использованные в работе
В работе были использованы:
• Образцы крови женщин, а также грудного молока разного срока лактации, предоставленные Отделением недоношенных детей НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта и городской больницей г. Кандалакша Мурманской области;
• культуры клеток молочной железы НС11, LA7, 106, любезно предоставленные проф. Дж. Мерло, Университет Телетон, Милан;
• беспородные белые крысы и кролики породы Шиншилла, полученные из питомника «Рапполово»;
• праймеры, соответствующие последовательностям 5'-фланкирующего региона гена ЦП крысы, синтезированные фирмой «ARK SCIENTIFI», peqlab Biotechnologie GmbH;
• праймеры, последовательно перекрывающие первые 3000 н. промоторной области гена ЦП человека, синтезированные фирмой «Литех», Москва;
• праймеры для ОТ-ПЦР на различные участки генов АТР7А и АТР7В, ЦП, GPI-ЦП и Ctrl, синтезированные фирмой «Syntol», Москва;
• полноразмерная кДНК-ЦП крысы, любезно предоставленная проф. Gitlin J.D. из Edward Mallinckrodt Department of Pediatrics, Washington University School of Medicine, Gildren’s Hospital, клонированная в плазмидах pCplg4 и pCP9B;
• антитела к транскрипционным факторам Spl и YY1- фирмы «Santa Cruz Biotechnology»;
• олигонуклеотиды (прописным жирным шрифтом выделен сайт для связывания соответствующего ТФ):
1) ggctccgcggCCATCTTggcggct - консенсусный сайт для связывания белка YY1 - SYC (SYM);