Образование комплекса при взаимодействии церулоплазмина и лактоферрина

• Автор: Пулина, Мария Олеговна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 105 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Общие принципы изучения белок-белковых взаимодействий
1.1.1. Типы ББВ
1.1.2. Структура и свойства поверхности контакта при ББВ
Топография поверхности контакта
Аминокислотный состав
Вторичная структура
1.1.3. Силы, определяющие белок-белко вое взаимодействие
Гидрофобное взаимодействие
Электростатические силы и заряды
Водородные связи
Молекулы воды в области контакта
1.1.4. Изменение конформации белков при ББВ
1.1.5. Термодинамика белок-белковых взаимодействий
1.1.6. Распределение характерных элементов по поверхности белкового
контакта
1.1.7. Факторы, влияющие на белок-белковое взаимодействие
1.2. Лактоферрин
1.2.1. Строение лактоферрина
1.2.2.Строение металлосвязывающих сайтов ЛФ
1.2.3. Биологические функции лактоферрина
Роль ЛФ в метаболизме железа
Лактоферрин как фактор роста
Противовоспалительное действие
Бактериостатическое и бактерицидное действие ЛФ
ЛФ как транскрипционный фактор
Эндонуклеазная активность ЛФ
1.3. Церулоплазмин
1.3.1. Строение ЦП
1.3.2. Атомы меди в составе ЦП, строение активного центра
1.3.3.Биологические функции ЦП
Транспорт меди
Участие в метаболизме железа
Регуляция уровня биогенных аминов
Антиоксидантные свойства ЦП
1.3.4. Взаимодействие ЦП с некоторыми белками, связывающими ионы
железа
Образование комплекса ЦП с ферритином в ходе загрузки ионов железа.

Ингибирование пероксидазной активности МПО при ее взаимодействии с

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Выделение ЛФ
2.2. Насыщение апоЛФ железом и медью

2.3. Выделение ЦП..:
2.4. Получение апо-ЦП
2.5. Получение экстракта из нейтрофильных лейкоцитов
2.6. Гель-фильтрация
2.7. Электрофоретический анализ белков
2.8. Получение специфических антител к ЛФ и ЦП человека
2.9. Иммунодиффузия
2.10. Иммуноэлектрофорез
2.11. Иммуноэлектродиффузия
2.12. Иммобилизация ЦП и ЛФ на Сефарозе
2.13. Аффинная хроматография ЛФ на ЦП-Сефарозе
2.14. Моделирование комплекса in vivo
2.15. Перенос ионов меди из холо-ЦП в апоЛФ
2.16. Окисление ЦП под действием Н2О2
2.17. Измерение оксидазной активности ЦП
2.18. Измерение хемилюминесценции
2.19. Спектры кругового дихроизма
2.20. Измерение ферроксидазной активности ЦП
РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Образование комплекса ЦП/ЛФ in vitro
3.2. Образование комплекса ЦП/ЛФ in vivo
3.3. Стехиометрическое соотношение комплекса ЦП/ЛФ
3.4. Условия разобщения комплекса ЦП/ЛФ
3.5. Влияние металлопростетических групп ЦП и ЛФ на формирование комплекса
3.6. Избирательность взаимодействия ЦП и ЛФ
3.7. Определение константы диссоциации
3.8. Взаимодействие ЛФ с частично протеолизованным ЦП
3.9. Перенос ионов меди из ЦП в апо-ЛФ
3.10. Влияние ЛФ на деградацию ЦП под действием Н2О2
3.11. Спектры кругового дихроизма (КД) для комплекса ЦП/ЛФ
3.12. Влияние ЛФ на ферментативную активность ЦП
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АТ — антитела
АФК - активные формы кислорода
ББВ — белок-белковое взаимодействие
ГАП — гидроксилапатит
ДМСО - диметилсульфоксид
ДЭАЭ — диэтиламиноэтил
КД - круговой дихроизм
КМ - карбоксиметил
ЛПС — липополисахарид
ЛСД - диэтиламид D-лизергиновой кислоты
ЛФ — лактоферрин
МБА - ИЫ'-метилспбисакриламид
МПО - миелопероксидаза
ПААГ - полиакриламидный гель
ПСА - персульфат аммония
ПФД - парафенилсндиамин
СОД — супероксиддисмутаза
ТЕМЕД - N,N,N',N'- тетраметилэтилендиамин
Трис - трис-(оксиметил)-аминометан
ТФ — трансферрин
УФ - ультрафиолет
ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид ФСК - фактор свертывания крови ЦП - церулоплазмин
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота ЭПР - электронный парамагнитный резонанс ЯМР - ядерный магнитный резонанс ELISA — Ensyme Linked Immunosorbent Assay Kd — константа диссоциации PBS - Phosphate Buffered Saline QAE - четвертичный аминоэтил SDS - додецилсульфат натрия

Барбитал растворялся только при кипении и перемешивании. Смешиванием равных объемов буферов 1 и 2 получали необходимый буферный раствор с pH 8,8.
Иммуноэлектрофорез проводили в 1% растворе агарозы, приготовленном на этом буфере. Необходимую толщину геля получали при расходе 1,9 мл агарозы на 1 см2 стеклянной пластины (чаще всего использовали пластину размером 60x90x1 мм и брали па неё 10 мл агарозы), оптимальную концентрацию антител в геле находили экспериментально. Чтобы приготовить пластину для ракетного иммуноэлектрофореза соответственное количество расплавленной 1 % агарозы охлаждали до +60°С, добавляли антитела или антисыворотку и выливали на стекло, расположенное строго горизонтально. После застывания агарозы делали лунки, необходимого размера (d=2-5 мм). Электрофорез проводили в течение 17 часов при напряжении 10 В/см, нанося на пробу 1-10 мкг белка. После электрофореза гель отжимали при помощи фильтровальной бумаги слоем 2-3 см, па которую помещали груз (10 г/см2) на 10 мин. Слой геля, превращенный в тонкую пленку, плотно прилегающую к стеклу, отмывали в физиологическом растворе и высушивали. Иммунопреципитаты окрашивали Кумасси бриллиантовым синим или о-дианизидином.
2.11. Иммуноэлектродиффузия.
Иммуноэлектродиффузию препаратов по Грабарю и Уильямсу проводили
согласно [Grabar et Williams, 1953]. Проведение таких экспериментов включало два этапа. Сначала проводится электрофорез препаратов в 1% растворе агарозы на основе буфера для иммуноэлектрофореза (см. выше) без добавления в гель антител в течение 1,5-3 часов. Для контроля за протеканием электрофореза к пробе добавляли краситель - бромфенол синий (1мкл 0,01% раствора). На втором этапе в геле прорезали бороздки шириной 2-3 мм, расположенные параллельно направлению электрофореза на расстоянии 5-10 мм по обе стороны от лунок, добавляли в бороздки разбавленную антисыворотку (оптимальную концентрацию находили эмпирически) и оставляли при комнатной температуре до развития дуг прецепитации (10-20 часов). Наиболее интенсивные дуги видны во влажном геле и без окраски, но для более четкой визуализации пластины окрашивали Кумасси бриллиантовым синим. Предварительно гель промывали в 1 М NaCl и PBS для удаления непрецепитировавших белков. Далее гель отжимали, высушивали и окрашивали, как и при проведении иммуноэлектрофореза.