Структурно-функциональные основы уникальной специфичности энтеропептидазы

• Автор: Лихарева, Виктория Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 132 с.

Список сокращений
I. Литературный обзор
1.1. Локализация энтеронептидазы

1.2. Структура энтеропептидазы
1.3. Активация проэнтеропептидазы
1.4. Трипсиноген - физиологический субстрат энтеропептидазы
1.4.1 Структурные модификации в процессе активации трипсиногена
1.5. Специфичность энтеропептидазы
1.6. Использование энтеропептидазы для процессинга химерных
белков
1.7. Вторичная специфичность сериновых протеиназ
1.8. “Энтеропептидазный линкер” -(Аяр^Ьуз- в составе природных
белков
1.9. Роль ионов кальция в энтеропептидазном катализе
1.9.1. Кальций-зависимый автолиз энтеропептидазы
1.9.2. Эффект ионов кальция на энтеропептидазный гидролиз
II. Результаты и обсуждение
Глава 1. Структура и иерархия субстрат-связывающих центров
энтеропептидазы
1.1 Первичная и вторичная специфичность энтеропептидазы
в сравнении с трипсином
1.1.1. Первичная специфичность
1.1.2. Вторичная специфичность
1.2. Эффективность энтеропептидазы
1.2.1. Субстрат г-Ьуз-З-В/І
1.2. Модификация трипсина и трипсиногена для обнаружения доменов субстрата, взаимодействующих с 8И-центром

энтеропептидазы 6'
1.2.2.1. ДФФ-трипсин
1.2.2.2. Ацетилированный трипсиноген
Глава 2. Особенности энтеропсптидазного катализа
2.1. Лимитирующая стадия
2.2. Эффект ионов кальция
Глава 3. Пептидные субстраты как модели природных и
искусственных белковых субстратов энтеропептидазы.
Кальций-зависимый автолиз энтеропептидазы
3.1. Гидролиз “неспецифических”субстратов энтеропептидазы
как модель автолиза
3.2. N-концевые пептиды мутантных катионных трипсиногенов
человека K23R и D22G
3.3. “Неспецифический” энтеропептидазный гидролиз белков
3.4. Потенциальные и экспериментально обнаруженные
центры автолиза энтеропептидазы
3.5. Физиологическая роль кальций-зависимого автолиза трипсина
и тяжелой цепи энтеропептидазы
III. Экспериментальная часть
1. Материалы
2. Методы
2.1. Очистка энтеропептидазы
2.2. Определение белка
2.3. Определение активности энтеропептидазы
2.4. Определение активности трипсина
2.5. Определение кинетических параметров гидролиза
синтетических субстратов 10*
2.5.1. Определение кинетических параметров гидролиза Z-Lys-S-Bzl
2.5.2. Определение кинетических параметров гидролиза
модельных пептидов
2.6. Изучения влияния ионов кальция на эффективность
энтеропептидазного гидролиза

2.7. Определение лимитирующей стадии реакции
гидролиза ряда синтетических субстратов энтеропептидазой
2.8. Получение апо-формы полноразмерной энтеропептидазы
и ее укороченной формы
2.9. Получение ДФФ-трипсина
2.10. Получение ацетилированного трипсиногена
2.10.1. Определение влияния ацетилированного трипсиногена
на процесс активации трипсиногена энтеропептидазой
2.10.2. Определение влияния ацетилированного трипсиногена
на гидролиз вО^-Жа энтеропептидазой
2.11. Гель-электрофорез
2.12. Масс-спектрометрический анализ
Выводы
Список литературы

долго ни в литературе, ни в наших экспериментах при гидролизе энтеропептидазой пептидов и белков не было зафиксировано такого чисто трипсинового типа гидролиза. Примером является вышеупомянутое отсутствие гидролиза пептида 12 после остатка Lysll, а также полная устойчивость к действию энтеропептидазы пептида 17. В этом случае трипсинолиз, так же как в случае субстрата 12« наблюдается (kcal/Kra= 1,4-105 mM''-мин'1).
Однако в данной работе мы показали, что один из наиболее эффективных
пептидных субстратов трипсина - пептид 16 - (к^/Кп, > 2-108 мМГ'-мин'1) все же
гидролизуется энтеропептидазой, но эффективность этого гидролиза на четыре
порядка ниже трипсинового (k^/Kn, = 1,4-104 mM''-мин'1). Нужно отметить, что
разница в четыре порядка в эффективности энтеропептидазного гидролиза
трипсиновых пептидных субстратов в пользу трипсина соответствует разнице в
эффективности гидролиза пептидов после остатков Lys или Arg химотрипсином по
сравнению с трипсином, и наоборот, после гидрофобных ароматических остатков

трипсином по сравнению с химотрипсином [95, 139, 140].
Представленное на рис. 6 различие в эффективности энтеропетидазного и трипсинового гидролиза пептидов общего вида в обоих крайних случаях (п = 4 и п
0) не менее разницы в гидролизе сериновыми протеиназами разной первичной специфичности своих соответствующих субстратов.
Таким образом, в результате проведенного нами исследования с помощью пептидных субстратов с линкером переменной длины (п = 0-4) показано, что энтеропептидаза, подобно другим сериновым протеиназам, обладает протяженным вторичным центром, взаимодействующим с шестью-семью аминокислотными остатками, расположенными по обе стороны от расщепляемой пептидной связч (РЗ/4-РЗ’). Однако это влияние проявляется лишь в случае субстратов с укороченным линкером, содержащих 1-2 остатка Asp/Glu, предшествующих Lys/Arg гидролизуемой связи; при этом вторичная специфичность энтеропептидазы отличается от вторичной специфичности трипсина (рис. 5). В случае типичных субстратов энтеропептидазы, содержащих четыре отрицательно заряженных остатка Asp/Glu в положениях Р2-Р5, превалирующим фактором эффективности гидролиза является электростатическое взаимодействие этих остатков с вторичным (S2) субстрат-связывающим центром (Lys889) легкой цепи энтеропептидазы. При этом